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猪圆环病毒(Porcine circovirus，PCV)是一种导致猪群免疫力下降的病毒，并与猪断奶后多系统衰弱综合症(Postweaning Multisystemic Wasting Syndrome,PMWS)、猪皮炎及肾病综合症(Porcine Dermatitis and Nephropathy Syndrome，PDNS)等多种疾病有着联系。疫苗是预防和控制猪群PCV感染的有效方式，目前已研发出病毒灭活苗、亚单位疫苗等多种PCV疫苗，但存在疫苗制备工艺复杂，减毒疫苗的低安全性、亚单位疫苗低免疫原性免疫保护效力局限等一些问题。猪圆环病毒主要由衣壳蛋白Cap蛋白和基因组构成，其中Cap蛋白是公认的主要免疫保护性抗原，将是PCV疫苗研制的有效候选抗原。DEC-205是一种表达于大多数APCs表面的受体，属于甘露糖受体家族，在抗原内化、处理及提呈的过程中扮演重要角色，尤其在对外源性抗原交叉提呈的过程中受到广大研究者的关注。目前国内外许多研究表明：将病毒的主要保护性抗原，如gag（Human Immunodeficiency Virus,HIV），EDⅢ(Dengue Virus,DENV)，通过化学或者基因工程技术将抗原与抗DEC-205单抗偶联，利用抗DEC-205抗体特异性靶向DEC-205特性，从而使抗原更加精确的靶向抗原提呈细胞，进而介导抗原提呈细胞对抗原高效的内化、处理以及提呈，最终诱导强劲的特异性免疫应答。本文选取了2型猪圆环病毒(Porcine circovirus，PCV2)主要结构蛋白(Capsidprotein, Cap)作为研究对象，将抗DEC-205单链抗体（single chain antibody fragmentagainst DEC-205, scFvDEC205）与Cap蛋白融合表达，制备出靶向DEC-205的猪圆环病毒疫苗scFvDEC205-Cap。通过动物免疫实验，分析和评价其细胞免疫和体液免疫应答水平以及抗体中和作用，同时，对猪圆环病毒疫苗scFvDEC205-Cap靶向树突状细胞增强抗原递呈的作用和机制进行了初步研究，将为研制安全高效的猪圆环病毒疫苗奠定实验基础。主要工作内容和结果有如下几点：①猪圆环病毒疫苗scFvDEC205-Cap的构建、重组表达与纯化通过分子克隆技术，构建重组质粒pET22b-scFvDEC205，并在大肠杆菌中诱导表达，经超声裂解，包涵体变性，亲和层析纯化、蛋白质复性，最终纯化出重组scFvDEC205-Cap蛋白。目的蛋白经SDS-PAGE和Western blot鉴定分析。②猪圆环病毒疫苗scFvDEC205-Cap的免疫应答分析体液免疫结果显示：免疫scFvDEC205、GFP两种蛋白的小鼠一免及二免后血清中抗Cap蛋白特异性抗体效价为阴性，免疫Cap蛋白诱发的小鼠血清抗Cap蛋白一免二免特异性抗体效价分别为1：200和1：1600；然而免疫融合蛋白scFvDEC205-Cap的小鼠血清抗Cap蛋白特异性效价明显高于单纯的免疫注射Cap蛋白（P<0.05），一免二免效价值达到1：800和1：6400。免疫融合蛋白scFvDEC205-Cap抗体效价略低于PCV2灭活苗（1：1600和1：12800），但差异性并不显著(P>0.05)；诱发中和抗体是疫苗的另一重要特征，本研究将二免28天分离的血清稀释后与PCV2孵育，然后将抗体病毒混合液感染PK-15细胞，最后通过抗Cap单克隆抗体检测PK15细胞内病毒载量。与ELISA结果一致，scFvDEC-205和GFP蛋白组中和抗体效价显示为阴性，Cap组的中和抗体效价为1：12，而重组scFvDEC205-Cap蛋白激发的小鼠中和抗体效价达到1：16，明显高于Cap组（p<0.05）；PCV2灭活苗组的抗体效价要远高于其他四组，其数值达到1：20。细胞免疫结果是利用scFvDEC205-Cap刺激体外分离培养的脾淋巴细胞，通过ELISPOT进行检测分析。结果显示：阴性组（scFvDEC205和GFP蛋白）表达IL-4和IFN-γ细胞数量均值分别为：185/182和190/193；scFvDEC205-Cap表达IL-4和IFN-γ细胞数量均值分别为：680/700高于Cap组395/410；略低于PCV2组710/720。③猪圆环病毒疫苗scFvDEC205-Cap靶向增强树突状细胞抗原递呈功能的作用机制初探。流式细胞分析结果显示，scFvDEC205-Cap能够在体外条件下刺激骨髓树突状细胞（bone marrow-derived cells，BMDCs)成熟，且与Cap蛋白相比大肠杆菌表达的scFvDEC205-Cap与BMDCs结合效率更高(P<0.05)，这说明scFvDEC-205能够诱导BMDCs成熟且能够特异性地与BMDCs表面甘露糖受体DEC-205结合。ELISA和ELISPOT结果显示：负载scFvDEC205-Cap的BMDCs可刺激脾淋巴细胞分泌表达IL-17、IFN-γ和IL-4，同时，T细胞分泌表达IFN-γ的能力要强于IL-4。此外，抗原提呈阻断实验结果显示：添加抑制剂后淋巴细胞在与负载scFvDEC205-Cap蛋白的DCs培养之后，表达IFN-γ的能力明显低于未添加任何抑制剂的空白对照组（p<0.05），此结果说明DEC-205介导Cap蛋白的抗原提呈过程中可能涉及到交叉提呈途径。以上研究结果显示：与传统的亚单位疫苗Cap相比，scFvDEC205-Cap可通过scFvDEC205的靶向作用，增强APCs的抗原加工处理与递呈作用，有效激发小鼠产生更强的体液免疫和细胞免疫应答，可能发挥更有效的免疫保护。本研究将为新型高效的猪圆环病毒疫苗研究奠定良好的实验基础，此外，靶向DEC205的疫苗设计策略也将为其他病原微生物疫苗研究提供借鉴。