研究目的:传统意义上的中药的寒热是依据几千年来临床用药经验归纳出来的,在现代临床辨证用药过程中仍具有指导性意义。然而如何采用现代科学技术和方法来探究中药寒热药性的分子机制已成为现代药性理论研究过程中的难点和突破点。棕色脂肪组织(BAT)可通过解耦联反应将能量以热量形式释放,从而保证能量代谢过程中能量得失平衡。BAT含有大量的脂肪油滴和线粒体,而解耦联蛋白(UCP1)就是存在于线粒体内膜上的棕色脂肪细胞的标志性蛋白,同时受转录元件辅激活蛋白(PGC-1a)的调控。在以往动物体内实验中,本课题组通过运用热检测分析技术和分子生物学方法发现寒热性中药对小鼠棕色脂肪组织中UCP1、PGC-1a的基因和蛋白表达差异存在一定的影响。本研究是在此工作基础上通过离体研究的方式检测典型寒热性中药对诱导成熟的棕色脂肪细胞中UCP1、PGC-1a的基因表达和蛋白表达的影响来探索中药寒热药性的分子生物学基础。研究方法:体外培养新生小鼠的原代背部前棕色脂肪细胞,MTT法检测背部脂肪前体细胞的增殖情况,然后使用经典的“鸡尾酒”法诱导原代前棕色脂肪细胞分化为成熟的棕色脂肪细胞,观察细胞形态变化。随后用十味寒性中药的含药血清(黄芩、黄连、黄柏、苦参、鱼腥草、龙胆草、葛根、栀子、青蒿、大黄)及其单体成分(栀子苷、黄芩苷、大黄素、黄连素、鱼腥草素钠、龙胆苦苷、黄柏碱、青蒿素、苦参碱、葛根素);十味热性中药的含药血清(附子、高良姜、白芷、肉桂、吴茱萸、三七、麻黄、姜黄、胡椒、当归)及其单体成分(高良姜素、姜黄素、乌头碱、吴茱萸碱、阿魏酸、辣椒素、麻黄碱、三七皂苷、异欧前胡素、芍药苷)处理诱导后的棕色脂肪细胞24h。24h后,采用荧光定量PCR技术检测小鼠背部成熟的棕色脂肪细胞中UCP1 mRNA、PGC-1amRNA的基因表达是否存在差异;采用Westernblot技术检测UCP1、PGC-1a的蛋白表达是否存在差异。研究结果:(1)MTT结果显示:在适宜浓度范围内部分寒性中药的单体成分能抑制原代前棕色脂肪细胞的增殖,使细胞收缩,变圆;部分热性药单体成分能促进细胞的生长,使细胞密度变大。(2)新生小鼠背部棕色脂肪细胞诱导成熟后出现大量油滴。(3)PCR结果显示:通过与对照组比较,发现部分寒性中药单体成分能使两种目的基因的表达呈下降趋势,龙胆苦苷、黄柏碱、苦参碱、葛根素能使细胞中UCP1基因表达相对量显著下降(P<0.05),栀子苷组、大黄素组、苦参碱组细胞中PGC-1 α基因表达相对量显著下降(P<0.05)。部分热性中药单体成分能使两种目的基因的表达呈上升趋势,乌头碱、吴茱萸碱能使细胞中UCP1基因表达相对量显著上升(P<0.05),麻黄碱能使细胞中PGC-1 α基因表达相对量显著上升(P<0.05)。与对照组相比,部分寒性中药含药血清能使两种目的基因的表达呈下降趋势,龙胆草、大黄能使细胞中UCP1基因表达相对量显著下降(P<0.05)。苦参、龙胆草、栀子、青蒿、大黄能使细胞中PGC-1 α基因表达相对量显著下降(P<0.01或P<0.05)。热性中药含药血清能使两种目的基因的表达整体上呈上升趋势,麻黄组、姜黄组细胞中UCP1基因表达相对量均有显著上升(P<0.05),吴茱萸组、麻黄组细胞中PGC-1 α基因表达相对量均显著上升(P<0.05)。(4)Westernblot结果显示:与对照组相比,部分寒性中药单体成分培养能使两种目的蛋白的表达呈下降趋势,大黄素组、苦参碱组、龙胆苦苷组、青蒿素组、鱼腥草素钠组细胞中UCP1蛋白表达相对量均有非常显著的下降(P<0.01)。部分热性中药单体成分能使UCP1蛋白的表达呈上升趋势,三七皂苷组、麻黄碱组、姜黄素组、阿魏酸组、乌头碱组、辣椒素组细胞中UCP1蛋白表达相对量显著上升(P<0.05或P<0.01)。与对照组相比,寒性中药苦参含药血清能使细胞中UCP1蛋白表达相对量显著下降(P<0.01)。热性中药吴茱萸含药血清能使细胞中UCP1蛋白表达相对量显著上升(P<0.05)。研究结论:(1)部分寒性中药单体成分能抑制原代前棕色脂肪细胞的增殖,使细胞密度降低,同时部分寒性中药含药血清及单体成分能抑制UCP1、PGC-1α的基因表达和UCP1的蛋白表达。(2)部分热性中药单体成分能促进原代前棕色脂肪细胞的增殖,使细胞密度变大,同时部分热性中药含药血清及单体成分能促进UCP1、PGC-1 α的基因表达和UCP1的蛋白表达。