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能源是人类社会发展的基础,随着石化燃料等非再生能源的日渐减少,新能源、清洁能源尤其是可再生能源得到了各国的关注。其中,以燃料乙醇为代表的生物燃料已经成为关注热点。如何利用廉价的,可再生的植物纤维素和半纤维素生产乙醇是当前研究的热点,其中半纤维素主要由木糖组成。由于酿酒酵母缺乏木糖异构酶以及没有足够酶活力的木酮糖激酶(木酮糖激酶是关键酶)不能直接代谢木糖生成乙醇。本项目研究木糖异构酶及木酮糖激酶基因克隆并在酵母中的表达与生物活性分析。本研究以E. coli DH5a基因组DNA为模板,通过PCR方法扩增木糖异构酶基因(xi)和木酮糖激酶基因(xk),并分别使其基因的3’末端融合了His标签,便于蛋白的纯化。克隆得到的DNA片段与pPIC9K、pGAP9K载体均用EcoRⅠ和NotⅠ双酶切后连接,然后转化大肠杆菌,获得了带有AOX1启动子的重组质粒(pPIC9K-xi、pPIC9K-xk)和带有GAP启动子的重组质粒(pGAP9K-xi、pGAP9K-xk)。利用电转化技术将线性化后的质粒pPIC9K-xi、pPIC9K-xk、pGAP9K-xi、pGAP9K-xk转化P. pastoris GS115,经MD板和700μg/mL的G418抗生素筛选得到多拷贝重组菌株GS115(pPIC9K-xi)、GS115(pPIC9K-xk)、GS115(pGAP9K-xi)、GS115(pGAP9K-xk)作为工程菌。外源蛋白的表达在摇瓶中进行,GS115(pPIC9K-xi)和GS115(pPIC9K-xk)以甲醇为唯一碳源,而GS115(pGAP9K-xi)和GS115(pGAP9K-xk)以葡萄糖为唯一碳源。SDS-PAGE分析结果显示,木糖异构酶和木酮糖激酶成功地在巴斯德毕赤酵母中分泌表达。随后用木糖发酵试验作活性分析,结果表明摇瓶发酵的重组木糖异构酶都具有生物活性。利用电转化技术将线性化后的质粒pGAP9K-xi和pGAP9K-xk转化酿酒酵母京龙1号,经MD板和700μg/mL的G418抗生素筛选得到多拷贝重组菌株JL1(pGAP9K-xi)、JL1(pGAP9K-xk)。摇瓶发酵工程菌株JL1(pGAP9K-xi)和JL1(pGAP9K-xk)表达木糖异构酶和木酮糖激酶。随后用木糖发酵试验作活性分析,结果表明摇瓶发酵的重组木糖异构酶具有生物活性。综上所述,本实验成功地克隆了木糖异构酶和木酮糖激酶基因,实现了在巴斯德毕赤酵母和酿酒酵母中表达木糖异构酶和木酮糖激酶。同时,证明了酵母表达来源于大肠杆菌的木糖异构酶具有活性。为今后构建直接利用来自半纤维素的木糖的酿酒酵母工程菌,直接代谢木糖生成乙醇,以及生产重组木糖异构酶和木酮糖激酶而应用于半纤维素乙醇的生产打下基础。