论文部分内容阅读
乳腺癌是世界上最常见的女性恶性肿瘤之一,其发病率在我国呈现逐年上升的趋势。目前针对乳腺癌治疗的手段依然比较局限,不能有效地控制术后肿瘤的复发和转移,这导致中、晚期乳腺癌患者的死亡率依然较高。现已证实,当同样受到放化疗损伤后,乳腺癌干细胞具有比普通乳腺癌细胞更强的自我修复能力。治疗后残存的极少量乳腺癌干细胞仍然可以增殖形成大量新的乳腺癌细胞,最终导致乳腺癌的复发和转移。鉴于乳腺癌干细胞在乳腺癌的发生、发展、预后、抗放化疗中起到重要作用,人们提出了针对乳腺癌干细胞的靶向治疗理论,这为彻底治愈乳腺癌及有效提高患者生存率提供了方向。UBE2T (ubiquitin-conjugating enzyme 2T)是一种新被发现的泛素偶联酶,该基因的高表达已经被证实与膀胱癌、前列腺、肺癌的发生密切相关。并且,我们之前研究已经证实：UBE2T通过促进前列腺癌细胞的上皮间充质转化(epithelial mesenchymal transformation, EMT)从而在前列腺癌的发生、发展中充当癌基因角色。报道称,在乳腺癌中UBE2T能够通过抑制乳腺癌抑癌基因BRCA1的表达从而促进乳腺癌细胞的增殖、转移。但是,目前尚无关于该基因在乳腺癌细胞干细胞特性中作用及机制的研究。本论文中,我们旨在探究UBE2T对乳腺癌细胞干细胞特性的调控作用及其分子机制,以期为乳腺癌的诊断和治疗提供新的思路。研究目的探究UBE2T对乳腺癌细胞干细胞特性的调控作用,并深入研究UBE2T调控乳腺癌细胞干细胞特性可能的分子机制。研究方法1.通过Western blotting及qRT-PCR实验检测UBE2T在人乳腺癌细胞BT549、HCC1428、MCF-7、MDA-MB-231及人正常乳腺上皮细胞MCF10A中的基础表达量,并为构建UBE2T稳定过表达和沉默乳腺癌细胞系提供依据。2.通过Western blotting及qRT-PCR实验探究UBE2T在乳腺癌组织和癌旁组织中表达水平的差异。3.将UBE2T基因过表达、UBE2T基因沉默的质粒及其各自对照空载质粒运用逆转录病毒感染的方法转入相应的乳腺癌细胞,并经过嘌呤霉素多次筛选,从而构建相应UBE2T稳定过表达和沉默的乳腺癌细胞系,并通过Western blotting及qRT-PCR实验验证,为下一步研究做准备。4.通过微球体形成实验(Sphere formation assay)和软琼脂克隆形成实验(Soft agar assay)检测UBE2T对乳腺癌细胞干细胞特性的影响。5.运用流式细胞技术分析UBE2T对乳腺癌细胞系中CD44+CD24-/low肿瘤干细胞比例的影响。6.通过Western blotting实验进一步探究UBE2T对肿瘤干细胞相关转录因子SOX2、OCT4、NANOG表达的调控作用,初步探究UBE2T调控乳腺癌细胞干细胞特性可能的分子机制。7.通过Western blotting实验探究UBE2T的表达变化对乳腺癌细胞中mTOR表达及磷酸化水平的影响。8.运用mTOR抑制剂-雷帕霉素(rapamycin)处理过表达UBE2T的乳腺癌细胞系,并通过Western blotting实验检测SOX2、OCT4和NANOG的表达变化,确定UBE2T是否经过mTOR的介导进而调控SOX2、OCT4和NANOG的表达,从而实现其对乳腺癌细胞干细胞特性的促进作用。9.运用mTOR抑制剂-雷帕霉素(rapamycin)处理UBE2T过表达的乳腺癌细胞系,通过微球体形成实验(Sphere formation assay)进一步研究mTOR在UBE2T基因增强乳腺癌细胞干细胞特性中的作用。研究结果1. Western blotting及qRT-PCR实验结果表明,UBE2T在人乳腺癌组织中的表达显著高于癌旁组织。2. Western blotting及qRT-PCR实验结果表明,UBE2T在人乳腺癌细胞BT549、HCC1428、MCF-7、MDA-MB-231中表达水平显著高于人正常乳腺上皮细胞MCF10A。在个乳腺癌细胞株中,恶性度和侵袭能力较高的MDA-MB-23.1、BT549表达量最高,恶性度和侵袭能力较低的MCF-7、HCC1428表达量次之。3. Western blotting实验验证建系结果：(1).成功构建立UBE2T过表达的乳腺癌细胞系MCF-7-pBabe-UBE2T、 HCC1428-pBabe-UBE2T及其各自对照细胞系MCF-7-pBabe-Vector、 HCC 1428-pBabe-Vector。(2).成功构建立沉默UBE2T表达的人乳腺癌细胞系BT549-pSuper-shUBE2T.A、 BT549-pSuper-shUBE2T.D、MDA-MB-231-pSuper-shUBE2T. A MDA-MB-231-pSuper-shUBE2T.D及其各自对照细胞系BT549-pSuper-Vector、 MDA-MB-231-pSuper。4.微球体形成实验和软琼脂克隆形成实验结果表明,过表达UBE2T能够显著增强乳腺癌细胞的干细胞特性,沉默UBE2T能够显著抑制乳腺癌细胞的干细胞特性。5.流式细胞实验结果表明,过表达UBE2T能够显著增加乳腺癌细胞系中CD44+CD24-/low肿瘤干细胞比例,沉默UBE2T表达能够显著抑制这一比例。6. Western blotting实验结果表明,过表达UBE2T能够显著促进干细胞转录因子SOX2、OCT4及NANOG的表达水平,沉默UBE2T表达能够显著抑制上述转录因子的表达。7. Western blotting实验结果表明,在乳腺癌细胞中过表达UBE2T能够促进mTOR表达及其磷酸化,沉默UBE2T能够显著降低mTOR表达及其磷酸化。8. Western blotting实验表明,UBE2T促进干细胞转录因子SOX2、OCT4和NANOG表达的能力可以被mTOR抑制剂-雷帕霉素(rapamycin)显著抑制。9.微球体形成实验的结果表明,UBE2T增强乳腺癌细胞球体微球体形成的能力可以被mTOR抑制剂-雷帕霉素(rapamycin)显著抑制。研究结论及意义我们的研究发现UBE2T对乳腺癌细胞的干细胞特性具有调控作用,并且证明UBE2T能够经mTOR的介导来调控SOX2、OCT4、NANOG的表达,从而实现其增强乳腺癌细胞干细胞特性的作用。该研究第一次发现了UBE2T对乳腺癌细胞干细胞特性的增强作用并阐释了其分子调控机制,这有可能为乳腺癌的诊断和治疗提供新的基因靶点。