研究背景和目的目前,由于饮食结构不合理以及缺乏足量的运动,胆固醇代谢紊乱的患者越来越普遍。而胆固醇代谢紊乱是公认的动脉粥样硬化的关键因素之一,与急性心肌梗死(Acute Myocardial Infarction, AMI)及脑卒中(Strock)等严重危害生命的疾病密切相关。肝脏作为人体最重要的代谢器官在胆固醇代谢方面也起着非常重要的作用,在各种肝脏疾病的患者中经常发现胆固醇代谢紊乱的情况。因此,当研究胆固醇代谢紊乱时,经常会考虑到肝细胞在其中的作用。Nur77(Nuclear Receptor Subfamily4Group A Member1, NR4A1)又称神经生长因子IB (Nerve Growth Factor I-B, NGFI-B),是1988年Milbrandt等用神经生长因子诱导大鼠嗜铬细胞瘤细胞系PC12后发现的一种新基因。它与Nurrl (NR4A2)和Norl (NR4A3)同属于NR4A孤儿核受体超家族,拥有经典的N端功能激活结构域、中间的DNA结合结构域以及C端的配体结合结构域。但是其配体结合结构域是非典型的,缺乏经典的核受体配体结合结构域中的配体接受袋和共激活位点。因此,他们没有特定的配体,其功能的调节不像普通核受体那样通过与配体结合,而是通过自身的表达以及翻译后的修饰。Nur77是一种快速反应基因,在生长因子、炎症等刺激下可以快速诱导表达。目前的研究证实,Nur77参与到很多生物学过程的调控,包括细胞凋亡、炎症反应、糖代谢以及骨骼肌细胞能量供应等生理与病理生理过程。在Nur77与肝脏脂质代谢的关系方面,已有的研究证实,Nur77参与小鼠脂质代谢的调控,可以通过抑制：SREBP1c的活性降低肝细胞甘油三酯的水平。然而,还没有明确的证据证实Nur77是否可以参与调控肝细胞对胆固醇的调控,特别是在人源性的肝细胞中更加不清楚。方法1、HepG2细胞培养条件的优化与Nur77RNA干扰条件的摸索在10%、15%、20%不同血清浓度下将HepG2细胞培养12h、24h、48h、72h后对细胞形态与数量进行比较,从而确定最佳的培养基血清含量。在相同初始细胞密度与培养条件下将HepG2细胞培养至生长汇合度为20%、50%、80%、90%、100%及汇合度为100%后再培养12h、24h,对不同汇合度时活细胞、死细胞数量及其比值分别进行比较,从而确定最佳的传代时机。对于相同生长条件的HepG2细胞,用PBS洗涤0、1、2、3、4、5次以后,对胰酶消化时间进行比较,从而确定最佳的传代条件。对于化学合成的三对siRNA片段,均选取50nM的终浓度对相同生长状况的HepG2细胞干扰24h,然后通过RT-PCR对Nur77的干扰效率进行比较,从而筛选出最佳的siRNA片段。选取以上干扰效果最好的siRNA片段,以50nM的终浓度对相同生长状况的HepG2细胞分别干扰24h、36h、48h,通过RT-PCR对Nur77的干扰效率进行比较,从而确定最佳的干扰时间。然后选取上述干扰效果最好的siRNA片段与干扰时间,分别以50nM、100nM的终浓度对相同生长状况的HepG2细胞实施干扰,通过RT-PCR对Nur77的干扰效率进行比较,从而确定最佳的干扰浓度。2、Nur77过表达质粒载体的构建、转染与过表达效果鉴定分别以PCR-XL-TOPO载体和PIRES2-EGFP载体为模版对Nur77和EGFP片段进行扩增,在Nur77上游添加EcoRI酶切位点扩增得到EcoRI-Nur77片段,在EGFP下游添加XhoI酶切位点,在上游添加IRES连接基因,扩增得到IRES-EGFP-XhoI。然后通过重叠PCR将上述两个片段进行连接,合成含有目的基因Nur77和EGFP的片段EcoRI-Nur77-IRES-EGFP-XhoI。通过双酶切将上述片段连入pcDNA3.1(+)载体构建成重组过表达载体质粒PcDNA3.1-Nur77。使用Lipofectamine2000将pcDNA3.1-Nur77转染至HepG2细胞,并通过RT-PCR与Western Blotting分别在mRNA水平和蛋白水平鉴定过表达效果。3、Nur77对HepG2细胞内胆固醇水平及其代谢调控相关基因的影响实验分为五组,空白组(Blank)、RNA干扰对照组(siRNA-NC)、RNA干扰组(siRNA-Nur77)、过表达对照组(pcDNA3.1-monk)、过表达组(pcDNA3.1-Nur77)。在siRNA或过表达重组质粒转染后6h进行换液时加入0.5nM的油酸、亚麻酸(2：1比例)混合物对HepG2细胞进行脂质过载培养。48h后对各组细胞进行裂解,比较各组细胞内总胆固醇(Total Cholesterol, TCHO)水平。相同条件下使用油红O染色对各组细胞的脂质水平进行鉴定。对于五组细胞,相同处理因素非脂质过载培养48h后对肝细胞胆固醇代谢调控的三个关键基因的mRNA水平和蛋白水平的表达进行比较。三个关键基因分别为：低密度脂蛋白受体(Low Density Lipoprotein Receptor, LDLR)、HMGCoA还原酶(HMGCoA Reductase, HMGCR)以及肝x受体a (Liver x Receptor a, LxRα)。4、Nur77激动剂CsnB对HepG2细胞胆固醇代谢调控基因的影响用含有10μg/mLCsnB浓度的培养基对HepG2细胞进行培养, Oh、0.75h、1.5h、3h、6h、12h以及24h后分别提取总RNA,用RT-PCR检测Nur77以及LDLR、 HMGCR、LXRa的mRNA相对表达量。对照组用CsnB溶剂DMSO代替CsnB,其他条件相同。对实验组与对照组不同处理时间各基因的变化与差别进行分析。5、统计学处理每组实验重复3次,采用SPSS13.0软件进行数据分析,计量数据以x±s表示。方差齐性检验采用Levene’s test。各培养时间点各血清浓度细胞数量的比较采用析因设计资料的方差分析(General Linear Model-Univariate),组间多重比较采用LSD法；不同汇合度细胞数量与比例的比较、各基因mRNA相对表达量三组及以上的组间比较、各蛋白Western Blotting条带的相对灰度值三组及以上的组间比较、经空白组校正后的HepG2细胞内TCHO/TP组间的比较采用单因素方差分析(One-way ANOVA),组间多重比较采用LSD法；方差不齐时采用Welch法,组间多重比较采用Dunnett’s T3法；各基因mRNA(?)目对表达量两组间比较、各蛋白Western Blotting条带相对灰度值两组间比较采用两样本t检验。P<0.05认为差异有统计学意义。结果1、HepG2细胞不同血清浓度的细胞密度的区别没有统计学意义(F=0.008,P=0.992),不同时间点的细胞密度的区别则有统计学意义(F=272.9,P<0.001)。不同汇合度下,活细胞数量、死细胞数量以及活细胞死细胞比例均不全相同(P<0.001),活细胞数随着汇合度的增加而增加,在汇合度达到90%和100%时升至最高,继续培养反而下降；死细胞数在汇合度达到90%及以前均变化不大,但在达到100%后迅速增加,继续培养上升明显；而活细胞与死细胞的比例在汇合度达到至80%和90%时升至最高,随后又下降。在不使用PBS冲洗时,需要大约5分钟时间贴壁细胞才能完全消化,但使用PBS冲洗后,仅需要2分钟就可以使贴壁细胞完全消化,并且冲洗次数的增加并没有使消化时间相应缩短。对于siRNA片段的筛选,相同条件下siRNA Segement1的干扰效果最好,使用50nM的终浓度对HepG2细胞干扰24小时后,Nur77mRNA的相对表达量可降至79%左右。不同干扰时间达到的Nur77mRNA干扰效果各组间不尽相同(F=54.7,P<0.001),随着干扰时间的增加,Nur77mRNA的相对表达量先下降后上升,其中干扰36h组的干扰效果最好,可将Nur77mRNA沉默至25%左右。不同siRNA浓度Nur77mRNA的干扰效果不尽相同(F=238,P<0.001),随着siRNA用量的增加,Nur77mRNA的相对表达量逐渐下降,siRNA用量最大(100nM)时Nur77mRNA的相对表达量可降至10%左右。使用以上条件对HepG2细胞Nur77实施干扰,实验组(siRNA-Nur77) Nur77mRNA的相对表达量降至10%左右(P<0.001vs.阴性对照),Western Blotting蛋白条带相对灰度值降至54%左右(P=0.004vs.阴性对照),沉默效果明显。2、通过酶切电泳与测序鉴定,成功构建了Nur77过表达载体pcDNA3.1-Nur77。并且其可以有效转染HepG2细胞,与Lipofectamine2000转染试剂的比例为1:2.5(μg:μL)转染48小时后,转染效率可达80%左右。与对照组pcDNA3.1-monk相比,实验组pcDNA3.1-Nur77的mRNA相对表达量升高至大约500倍(P<0.001vs.阴性对照),Western Blotting条带相对灰度值升高至大约3.7倍(P=0.001vs.阴性对照),过表达效果显著。3、各组细胞经空白组校正后的总胆固醇水平(TCHO/TP)的差异有统计学意义(F=107.5,P<0.001)。其中Nur77RNA干扰组较干扰阴性对照组升高至1.3倍左右(1.34±0.04vs.1.04±0.03, P﹤0.001), Nur77过表达组相比过表达阴性对照组降至76%左右(0.74±0.01vs.0.97±0.06,P<0.001),相应的差异均有统计学意义。油红O染色证实了上述细胞内胆固醇水平的改变。对于肝细胞胆固醇代谢的主要调控基因,在Nur77抑制之后LDLR mRNA相对表达量相比对照组升高至1.7倍左右(1.836±0.104vs.1.108±0.056), Western Blotting蛋白条带的相对灰度值相比对照组升高至1.5倍左右(1.167±0.105vs.0.797±0.075),而在Nur77过表达之后LDLR mRNA相对表达量相比过表达对照组降低至45%左右(0.412±0.067vs.0.925±0.068), Western Blotting蛋白条带的相对灰度值相比过表达对照组降低至46%左右(0.300±0.046vs.0.653±0.045),相应差异均有统计学意义(P<0.001)。对于HMGCR,在Nur77抑制之后mRNA相对表达量相比对照组升高至1.8倍左右(1.608±0.105vs.0.914±0.041), Western Blotting蛋白条带的相对灰度值相比对照组升高至1.4倍左右(1.593±0.125vs.1.103±0.081),而在Nur77过表达之后mRNA相对表达量相比过表达对照组降低至51%左右(0.570±0.081vs.1.116±0.054), Western Blotting蛋白条带的相对灰度值相比过表达对照组降低至54%左右(0.510±0.046vs.0.943±0.075),相应差异亦均有统计学意义(P<0.001)。然而,LxRa mRNA相对表达量与Western Blotting蛋白条带的相对灰度值并不随Nur77的改变而明显变化。4、HepG2细胞经10μg/mLCsnB处理后各时间点间Nur77mRNA相对表达量变化明显,差异有统计学意义(F=36.1,P<0.001)。在处理后1.5h达到高峰,大约为0h的2.65倍,随后开始下降,在12h基本降至基础水平。LDLR在CsnB处理后mRNA相对表达量呈下降的表现,尤其是在作用时间增至12h与24h时下降明显,不同时间点之间的差异具有统计学意义(F=60.7, P<0.001); LDLR在DMSO处理后mRNA相对表达量也呈下降的表现,但是其下降趋势与CsnB处理组相比明显放缓；对于24h时间点,LDLR的nRNA相对表达量在CsnB处理组与DMSO对照组之间的差异亦有统计学意义(t=-6.6, P=0.003)。HMGCR在CsnB处理后mRNA相对表达量呈下降的表现,不同时间点之间的差异具有统计学意义(F=5.0,P＝0.003)；而CsnB处理组相比DMSO对照组HMGCR mRNA相对表达量下降明显(F=4.6,P=0.042)。而对于LxRa,其在CsnB处理后mRNA相对表达量变化并不明显,不同时间点之间的差异没有统计学意义(F=0.7,P=0.612)；CsnB处理组与DMSO对照组相比差异也没有统计学意义(F＝1.3,P=0.266)。结论1、对于本实验室获得的HepG2细胞,使用10%血清浓度的DMEM培养基对HepG2细胞进行培养,在汇合度达到90%左右时进行传代,传代时用PBS对贴壁细胞冲洗一次,然后用胰酶消化可以获得较好的效果。基于本实验室的HepG2细胞培养条件与RNA干扰条件,siRNA Segementl是最佳的siRNA片段,使用100nM的终浓度干扰36h可以获得较好的Nur77mRNA干扰效果。2、通过分子克隆成功构建了Nur77过表达重组质粒pcDNA3.1-Nur77,与Lipofectamine2000转染试剂的比例为1:2.5(μg:μL)转染48小时后,能够在HepG2细胞中达到较好的过表达Nur77的效果。3、Nur77参与了HepG2细胞胆固醇代谢的调控,可以降低HepG2细胞内胆固醇的水平。这种作用可能与Nur77降低HepG2细胞LDLR与HMGCR的水平有关。4、Nur77的天然激动剂CsnB可以有效地诱导Nur77在HepG2细胞中的高表达,并且可以使HepG2细胞LDLR与HMGCR表达下降,而LXRa表达变化不大,这与过表达重组质粒达到Nur77过表达后相关基因的变化趋势一致。