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背景肝细胞肝癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)死亡率高,是威胁人类健康的重大疾病之一。多数HCC均由慢性肝脏炎症和肝纤维化发展而来,深入研究HCC的发病机制,寻求特异的药物作用靶点,开发新的药物,阻断慢性肝炎-肝纤维化-HCC的发展过程是防治HCC的重要途径。TGF-b信号通路是迄今研究最为深入、与肝脏慢性炎症-纤维化-HCC转化关系最为紧密的信号通路之一,在抗肝纤维化-HCC药物的机制研究中受到特别关注。TGF-β1通过Ⅰ型TGF-b受体(TGF-btypeⅠreceptor,TbRⅠ)磷酸化Smad2、Smad3的C末端(C-terminal region,C),另一方面活化促分裂原活化蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinase,MAPK)通路,包括细胞外信号调节激酶(Extracellular signal-regulated kinase,ERK)通路、c-Jun氨基端激酶(c-Jun N-terminal kinase,JNK)通路和p38通路,磷酸化Smad2、Smad3的连接区(Linker region,L),形成多种Smad2/3磷酸化亚型。其中p Smad3C传递生长抑制信号,p Smad2L/C传递促纤维化信号,p Smad3L传递促癌信号。上述Smad信号的传递均需与Smad4共同构成Smad2/3/4复合物,并借助于核质转运受体importin家族中的Imp7和Imp8,转运进入细胞核内调控靶基因如纤维蛋白溶酶原激活物抑制剂(Plasminogen activator inhibitor,PAI-1)的转录。而Smad7则对TGF-β/Smad信号通路产生反馈抑制作用。此外,TGF-β/Smad信号通路还通过与micro RNA之间的相互作用调控HCC发生发展,以具有抑癌作用的mi R-145和促癌作用的mi R-21尤为重要。复方芪参提取物(Compound Astragalus and Salvia miltiorrhiza extract,CASE)是对黄芪与丹参的有效成分黄芪总苷、黄芪多糖、丹酚酸进行配伍组方而成。本课题组前期研究显示CASE在体内、外均能发挥抗肝纤维化-HCC效应,并通过体外研究证实了CASE对TGF-β/Smad信号通路的调控作用;在二乙基亚硝胺(Diethylinitrosamine,DEN)诱导的大鼠肝纤维化-HCC模型中发现CASE可阻止肝纤维化-HCC发展过程中p Smad3C的生长抑制信号向p Smad2L/C的促纤维化信号和p Smad3L的促癌信号转化。但CASE对Smad4、Smad7、PAI-1以及负责Smad转运入核的Imp7/8表达的影响仍缺乏体内研究证据,而CASE是否对与TGF-β/Smad信号通路关联密切的mi R-145和mi R-21表达产生调控作用也尚不明确。为此,我们拟通过体内、体外实验进一步明确CASE的抗肝纤维化-HCC机制。目的1.在DEN诱导的大鼠肝纤维化-HCC动态模型中,明确CASE对Smad4、Smad7及下游PAI-1和Imp7、Imp8表达的影响;2.在DEN诱导的大鼠肝纤维化-HCC动态模型和Hep G2细胞中,明确CASE对mi R-21、mi R-145表达的影响。方法1.实验动物分组、模型构建及处理180只清洁级健康雄性SD大鼠,随机分为正常对照组,DEN模型组,CASE低、中、高剂量(60、120、240mg/kg)治疗组,阳性药物对照组(即护肝片组,921mg/kg),每组30只。DEN模型组、CASE低、中、高三个剂量治疗组以及阳性药物对照组的大鼠给予0.2%DEN溶液灌胃至14周,构建肝纤维化-HCC动态模型;正常对照组给予等量溶媒灌胃。从造模之日开始至第16周实验结束,CASE三个剂量治疗组大鼠分别给予不同剂量的CASE溶液灌胃,阳性药物对照组给予护肝片溶液灌胃;正常对照组和DEN模型组给予相应溶媒灌胃。在实验第12周和第16周结束时,分2批处死大鼠。2.细胞培养分组及处理Hep G2细胞体外培养,更换无血清的DMEM同步化细胞。同步化后分别加入TGF-β1(终浓度为9pmmol﹒L-1)活化细胞,时间分别为3h、6h、12h和24h,以未活化的细胞为对照,提取总RNA待测;Hep G2细胞体外培养,分为对照组、模型组和CASE20、40、80mg﹒L-1浓度处理组。更换无血清的DMEM同步化细胞,CASE 20、40、80mg﹒L-1浓度处理组分别加入相应浓度的药物,继续培养24h。为检测CASE对mi R-145和mi R-21的影响,分别在培养结束前3h或药物处理的同时加入TGF-β1活化细胞,对照组加入相应溶媒。提取总RNA待测。3.免疫组化法检测肝脏组织中Smad4、PAI-1蛋白制作组织芯片,分别用鼠抗Smad4多克隆抗体、兔抗PAI-1多克隆抗体孵育切片,加入二抗后,DAB显色,苏木精复染,在光学倒置显微镜下拍摄照片,胞浆出现棕黄色认定为阳性反应,采用Image J软件测定平均光密度值(Mean density),计算其平均值,反映蛋白表达的水平,进行定量比较。4.Western blot法检测肝脏组织中Smad4、Smad7、PAI-1、Imp7、Imp8从液氮冻存的肝脏组织中提取总蛋白,分别采用鼠抗Smad4多克隆抗体、羊抗Smad7多克隆抗体、兔抗PAI-1多克隆抗体、兔抗Imp7多克隆抗体、兔抗Imp8多克隆抗体,检测Smad4、Smad7、PAI-1、Imp7和Imp8蛋白表达,以GAPDH为参照。5.q RT-PCR检测mi R-145和mi R-21从液氮冻存的肝脏组织和Hep G2细胞中提取总RNA,反转录后,分别采用mi R-145、mi R-21、内参U6的鼠源或人源引物,SYBR GreenⅠ实时定量PCR反应检测mi R-145和mi R-21相对表达量,根据融解曲线确定扩增反应特异性。结果1.CASE对DEN诱导的大鼠肝纤维化-HCC模型中Smad4表达的影响在第12周肝纤维化期,免疫组化检测显示,DEN模型组肝组织内Smad4表达较正常对照组显著增加,低、中、高三个剂量CASE均可抑制DEN诱导的肝纤维化过程中Smad4表达;western blot检测结果与免疫组化检测结果基本一致,中、高剂量的CASE可显著抑制DEN诱导的肝纤维化过程中的Smad4的表达。在第16周肝癌期,免疫组化检测显示:与对照组比较,DEN模型组癌旁组织内Smad4表达显著增加,而肝癌组织内Smad4几乎未见表达。低、中、高三个剂量CASE治疗组肝组织Smad4蛋白表达与DEN模型组癌旁组织相比显著降低,并呈剂量依赖性。western blot检测结果与免疫组化检测结果基本一致,显示CASE可抑制DEN诱导肝癌过程中的Smad4蛋白的表达。2.CASE对DEN诱导的大鼠肝纤维化-HCC模型中PAI-1表达的影响在第12周肝纤维化期和16周肝癌期,免疫组化和western blot均显示:DEN模型组PAI-1表达较正常对照组显著增加,低、中、高三个剂量组CASE可明显抑制DEN诱导的PAI-1表达。3.CASE对DEN诱导的大鼠肝纤维化-HCC模型中Smad7表达的影响在第12周肝纤维化期和16周肝癌期,western blot显示:DEN模型组Smad7表达较正常对照组显著减少,低、中、高三个剂量组CASE可明显上调Smad7表达。4.CASE对DEN诱导的大鼠肝纤维化-HCC模型中Imp7和Imp8表达的影响在第12周肝纤维化期,western blot显示:DEN模型组Imp7和Imp8表达均较正常对照组显著增加,低、中、高三个剂量组CASE可明显抑制Imp7和Imp8表达。在第16周肝癌期,western blot显示:DEN模型组Imp7和Imp8表达均较正常对照组显著增加,高剂量CASE可明显抑制Imp7和Imp8表达,而低、中剂量CASE对Imp7和Imp8表达则无明显抑制作用。5.CASE对DEN诱导的大鼠肝纤维化-HCC模型中mi R-145表达的影响在第12周肝纤维化期,DEN模型组mi R-145表达较正常对照组显著增加。低、中、高三个剂量CASE治疗组肝组织中mi R-145表达较DEN模型组进一步明显增加。在第16周肝癌期,DEN模型组mi R-145表达较正常对照组显著降低。中、高剂量CASE治疗组mi R-145表达较DEN模型组显著上调,但仍显著低于正常对照组,而低剂量组mi R-145表达未见明显恢复。6.CASE对DEN诱导的大鼠肝纤维化-HCC模型中mi R-21表达的影响在第12周肝纤维化期,DEN模型组mi R-21表达较正常对照组略低。低、中、高三个剂量CASE治疗后,各剂量组mi R-21表达均较DEN模型组显著上调。在第16周肝癌期,DEN模型组mi R-21表达显著低于正常对照组。低、中、高三个剂量CASE治疗组肝组织中mi R-21表达较DEN模型组进一步下调。7.Hep G2细胞中CASE对TGF-β1诱导的mi R-145表达的影响在Hep G2细胞中,TGF-b1作用3h、6h和12h后mi R-145表达显著下调。20、40、80μg/ml CASE预处理24h,可恢复mi R-145表达,较非CASE处理组显著升高,以高剂量组效果最为明显。8.Hep G2细胞中CASE对TGF-β1诱导的mi R-21表达的影响在Hep G2细胞中,TGF-b1作用3h、6h、12h和24h后mi R-21表达显著上调。20、40、80μg/ml CASE预处理24h,可抑制TGF-b1诱导的mi R-21表达,mi R-21表达水平较非CASE处理组显著下降。结论1.抑制PAI-1表达可能是CASE抗肝纤维化-HCC作用的重要机制,PAI-1或可成为药物治疗肝纤维化-HCC疗效的判定指标之一。2.抑制Smad4蛋白表达,可能是CASE抗肝纤维化-HCC的作用机制之一。3.CASE治疗显著上调Smad7表达,可能通过Smad7对TGF-β/Smad信号的负反馈调节发挥抗肝纤维化-HCC作用。4.抑制Imp7和Imp8表达可能是CASE减少Smad促纤维化和促癌信号转运入核的机制之一。5.CASE可能通过上调mi R-145表达和抑制mi R-21表达发挥抗HCC作用,但与其抗肝纤维化作用无关。