论文部分内容阅读
本研究的目的,是开发具有骨髓保护作用的药物,以应对恶性肿瘤大剂量化疗或者血液恶性病的治疗过程中所带来的骨髓抑制副作用。我们的实验模型是通过5-氟尿嘧啶(5-Fu)一次性注射小鼠,导致骨髓抑制和随后的骨髓再生修复。5-Fu注射后小鼠外周血和骨髓细胞数量先是下降,到第7天降至最低,然后逐渐回升,到第14天恢复到用药前水平,其血象的变化与人5-Fu化疗后血象变化规律一致,是研究骨髓再生机理的经典动物模型。我们认为对骨髓再生具有调节作用的因子在化疗后骨髓恢复的过程中,其基因表达水平会出现一定的波动。根据该假设我们研究了5-Fu注射后14天之内骨髓细胞RNA的变化,发现IFN-γ诱导的单核因子(Mig)及其受体CXCR3的表达呈现先上升后下降的趋势。我们又取5-Fu注射后0、3、7、11、14天的小鼠血清,用ELISA检测血清中Mig因子的水平,发现Mig在正常小鼠血清中含量非常低,但是在5-Fu注射后第7天其浓度是正常水平的10倍以上,与芯片数据相一致。综上,我们认为Mig很有可能在骨髓抑制恢复的过程中发挥重要作用。我们首先利用原核表达pET系统表达了重组人和小鼠的Mig蛋白,并利用离子交换层析方法进行纯化,得到了纯度分别为99%和95%的产物,并检测证明具有生物学活性,为Mig的功能研究打下了基础。我们从两个方面研究Mig对骨髓系统的作用。一,我们通过在体表达和重组蛋白注射两个方法研究使用Mig因子对小鼠的骨髓的作用;二,我们制备了重组小鼠Mig蛋白的多克隆抗体血清,观察使用抗体中和小鼠自身的Mig能否促进受损骨髓的恢复。为了进行第一部分的功能研究,我们构建了真核细胞表达的重组质粒pcDNA-Mig,使用电脉冲方法,将质粒转染到小鼠的胫前肌。用小鼠Mig的ELISA试剂盒检测质粒转染后小鼠的血清,证实转染能够产生维持7天左右的M ig的暂时高表达。检测电转染之后小鼠的血象和骨髓细胞数量,比较pcDNA-Mig质粒组和pcDNA3.1质粒对照组的小鼠,发现Mig能够降低骨髓细胞总数,这种现象第5天即可观察到,维持到第10天,第27天得到恢复。股骨切片HE染色显示,pcDNA-Mig组比pcDNA3.1对照组骨髓细胞数量较低的时期,pcDNA-Mig组的小鼠骨髓中髓窦数量较多,直径较大。这可能与Mig的脉管抑制作用有关。进一步将此方法应用到小鼠5-Fu骨髓抑制模型上,在质粒转染之后7天,对小鼠尾静脉注射5-Fu,剂量为200μg/kg体重。以注射5-Fu当天作为第0天,我们在第0、3、7、11、14天共5个时间点小鼠的外周血白细胞和骨髓细胞,并作股骨切片。细胞计数显示,在第11天pcDNA-Mig组的白细胞和骨髓细胞数量皆高于对照组,第14天两组的白细胞和骨髓细胞数量都恢复到正常水平。骨髓切片显示,第7天pcDNA-Mig组的骨髓损伤情况较对照组轻,有核细胞数量多,排列较规则,第11、14天的骨髓细胞密度大,形态规则;相比之下,对照组的骨髓在相同时间点的细胞数量较少。综合细胞计数与骨髓切片,我们得出结论,在5-Fu注射之前转染表达Mig的质粒,能够降低小鼠骨髓的损伤,促进其恢复。质粒转染作为基因治疗的一种,虽然能够有效的导入外源基因,但是对机体造成的损伤较大,表达量难于控制,安全性较差。而有活性的重组小鼠Mig蛋白(rMuMig)尾静脉注射可发挥同样的作用。我们首先观察rMuMig蛋白对正常小鼠骨髓的影响。选用0.15、1.5、15μg/kg体重三个剂量的rMuMig尾静脉注射小鼠,对照组注射同样体积的PBS。四组小鼠每天注射一次,连续注射5天,以开始注射的时间作为第0天,分别检测了第0、5、10、15共4个时间点小鼠的外周血白细胞以及骨髓细胞总数的变化,结果显示15μg/kg组能够强烈抑制外周血白细胞、血小板与骨髓细胞数量,1.5μg/kg能够引起骨髓细胞的明显变化,而更低剂量对造血系统没有明显作用。15μg/kg组的小鼠股骨切片与对照组对比,第5天髓窦和血管明显扩张,与对照组的相同部位相比,同样大的视野下观察到的髓窦数量多,直径大;第10天这种现象没有改善;第15天髓窦数量有所回降,直径也缩小;第20天,骨髓恢复到与对照组相似水平,髓窦数量和大小皆接近正常。这些结果与质粒转染后小鼠的骨髓反应相似。我们选取10μg/kg体重的剂量,进一步观察rMuMig对5-Fu化疗小鼠的作用。我们采取两组给药方法,一种是先注射rMuMig,然后注射5-Fu;一种是先注射5-Fu,8小时后开始注射rMuMig。对照组注射等体积PBS代替蛋白溶液。统计发现,在250mg/kg体重的5-Fu作用下,对照组的小鼠只有10%左右的存活率,而先注射rMuMig可以将存活率提高到50%以上,但是先注射5-Fu后注射rMuMig的组小鼠全部死亡。检测5-Fu注射后第0、3、7、11、14共5个时间点小鼠的外周血以及骨髓细胞,发现提前注射rMuMig的小鼠,其外周血白细胞和骨髓细胞数量的恢复皆好于对照组。特别是第14天对照组的骨髓细胞数量只有正常水平的1/10左右,而提前注射rMuMig的小鼠已恢复至接近正常水平。我们取两组小鼠的股骨做了切片,HE染色观察其形态学变化,发现在第0天蛋白组小鼠髓窦较多,髓窦直径较大,这与前面实验的结果吻合;第3天两组细胞减少,但没有明显的组间差异;第7天可见对照组小鼠的骨髓损伤较大,出现大面积空腔,而蛋白组相对损伤较小,空腔的数量少面积小,骨髓细胞排列较对照组有规则;第11天的rMuMig组小鼠骨髓中可以观察到脂肪细胞的出现,但是在第14天脂肪细胞即消失,代之以造血细胞。该实验证实,提前注射rMuMig,能够对5-Fu化疗的小鼠骨髓起到保护作用,从而有利于化疗后骨髓的恢复。我们利用rMuMig免疫大鼠得到anti-Mig的抗体血清,理论上能够中和小鼠Mig蛋白,从而拮抗Mig对骨髓所起的作用。因此在注射250μg/kg体重的5-Fu之后,从第1天开始,每天一次,连续十天对小鼠皮下注射抗体血清,以未经Mig免疫的血清作为对照,观察对小鼠骨髓抑制后恢复的影响。结果发现,注射对照血清的小鼠在11天之内全部死亡,而注射anti-Mig血清的小鼠存活率高达60%左右。股骨切片结果与提前注射rMuMig蛋白后注射5-Fu的小鼠相似,即第11、14天anti-Mig抗体血清组的恢复好于对照组。先注射rMuMig蛋白,然后注射250mg/kg 5-Fu之后,分别给予相同剂量的对照血清和anti-Mig抗体血清,发现给予anti-Mig抗体血清的小鼠其恢复明显好于对照血清组,在第14天外周血白细胞和骨髓细胞数量都较高。该实验进一步证实在5-Fu之后使用anti-Mig抗体血清拮抗小鼠本身的Mig蛋白,能够促进骨髓和造血系统的恢复。为了进一步探讨Mig保护骨髓的机制,我们对正常小鼠和化疗恢复期小鼠注射rMuMig,然后分离其骨髓单个核细胞,进行细胞周期检测,发现rMuMig能够降低单个核细胞处于S期的比例。取小鼠注射PBS或者rMuMig,然后分离骨髓细胞进行集落培养,发现注射rMuMig之后的小鼠其得到的集落总数降低。由此,我们推测rMuMig可能通过抑制造血祖细胞进入S期,从而避过S期敏感的化疗药物5-Fu的作用,使得化疗过程中更多的祖细胞存留下来并进入分裂增殖,加快骨髓的恢复。综合以上实验结果,我们能够得出结论:在化疗之前应用rMuMig蛋白,以及在化疗之后拮抗小鼠本身的Mig蛋白,都能够对小鼠化疗损伤的骨髓起到正面作用。而根据blast结果,人与小鼠的Mig蛋白具有68%的同源性,并且有82%的序列相似性,在功能上二者也是相似的,因此我们推论,人Mig也可以应用在人的化疗中,起到与小鼠Mig相似的作用。本文工作为开发基于Mig的人化疗保护药物奠定了实验基础。