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[背景与目的]肺癌是常见的恶性肿瘤,近年来其发病率呈上升趋势,以非小细胞肺癌(Non-small cell lung cancer, NSCLC)的发病率最高。肺癌的发病机理、发展过程以及预后存在性别变化,吸烟的女性比吸烟的男性更容易发展为肺癌,但是女性患者的预后却比男性患者的预后好,女性患者有更长的生存期。肺癌中胃泌素释放肽的水平依性别而变化,其中包括甲状旁腺激素相关蛋白(Parathyroid hormone-related protein, PTHrP)。有三分之二的NSCLC表达PTHrP,这种因子是否在女性患者中减慢了肺癌的生长,从而使女性患者比男性患者有较好的预后,PTHrP是否可作为肺癌预后的独立指征有待进一步研究。PTHrP除导致恶性肿瘤高钙血症,还改变癌细胞的增殖率、调节癌细胞的凋亡倾向及基质金属蛋白酶的表达、阻止肿瘤血管生成,这些影响使PTHrP能够调节肿瘤的进展、改变肿瘤对治疗的敏感性、在不同方面影响肿瘤的进程,有研究表明PTHrP在几种动物的恶性肿瘤模型中影响肿瘤的进展。大量的研究提示PTHrP在肺癌中导致高钙血症,但其在肺癌的进展或生存预后方面的作用研究很少。本研究探讨性激素调节PTHrP的分泌、PTHrP的表达、PTHrP的表达和NSCLC患者性别及生存率的关系。[方法]第一部分细胞实验实验细胞株：人肺腺癌A549细胞株(Human lung adenocarcinoma A549cell line, A549),云南个旧肺鳞癌YTMLC-90细胞株(Human lung squamous cell carcinoma YTMLC-90cell line, YTMLC-90)。阳性对照细胞株：人前列腺癌LNCaP细胞株(Human prostate carcinoma LNCaP cell line, LNCaP),为雄激素受体(AR)表达阳性细胞系；人乳腺癌MCF7细胞株(Human breast carcinoma MCF7cell line, MCF7),为雌激素受体(ER)表达阳性细胞系。1.细胞复苏、培养及传代。2.用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)及Western免疫印迹法(Western Blot),检测实验细胞株和阳性对照细胞株中的ER-α、ER-p, AR和PTHrPmRNA、PTHrP蛋白的表达情况。3.将A549、YTMLC-90细胞在6孔板中培养生长48小时至对数生长期,再分别用0.5nM、InM、5nM、1OnM的17β-雌二醇和睾酮与A549、YTMLC-90细胞共同培养48小时,再用实时荧光定量聚合酶链反应(Real-time quantitative PCR)检测性激素刺激前后的A549、YTMLC-90细胞中PTHrPmRNA的表达。第二部分动物实验1.复苏、培养肿瘤细胞：将A549. YTMLC-90细胞培养至对数生长期。2.建立荷瘤动物模型：4-6周龄,雌性和雄性Nu/Nu(SPF级)裸鼠100只,其中雌性70只,雄性30只。按实验处理方法的不同将雌性裸鼠随机分为A组、B组、C组、D组共四组,雄性裸鼠随机分为E组、F组共两组。雌性实验组(A组,20只)：10只接种A549细胞、另外10只接种YTMLC-90细胞,从接种肿瘤细胞当天开始,于裸鼠的左后肢肌肉注射睾酮,0.2mg/d,共注射28天；雌性实验对照组(B组,20只)：10只接种A549细胞、另外10只接种YTMLC-90细胞；雌性安慰剂对照组(C组,20只)：10只接种A549细胞、另外10只接种YTMLC-90细胞,从接种肿瘤细胞当天开始,于裸鼠的左后肢肌肉注射生理盐水,0.2mg/d,共注射28天；雌性空白对照组(D组,10只)：不做任何实验处理。雄性实验对照组(E组,20只)：10只接种A549细胞、另外10只接种YTMLC-90细胞；雄性空白对照组(F组,10只)：不做任何实验处理。用裸鼠的癌组织及肺组织行HE染色病理诊断、免疫组织化学分析。用血清测睾酮、白细胞介素8(IL-8)；癌组织匀浆上清液测肿瘤总蛋白含量、PTHrP蛋白、PTHrPmRNA:肺组织匀浆上清液测PTHrP蛋白、PTHrPmRNA。第三部分临床实验125例非小细胞肺癌患者,男性73例,女性52例。纳入标准：临床资料完整,行肺癌根治术,经组织病理学诊断为非小细胞肺癌；排除标准：术前曾接受化疗、放疗及免疫治疗；合并其他器官肿瘤；合并免疫系统疾病；合并其它慢性消耗性疾病。1.标本包括癌组织、癌旁组织及远端正常肺组织各两份。(远端正常肺组织：距离癌组织边缘5cm以上的肺组织；癌旁组织：间于癌组织和远端正常肺组织之间的组织)2.所取标本一份用10%甲醛固定后送病理科做病理切片,并用免疫组织化学法分析PTHrP蛋白的表达；另外一份标本用实时荧光定量聚合酶链反应法分析PTHrPmRNA的表达。3.随访：对纳入实验组的男、女非小细胞肺癌患者进行跟踪随访,分析其PTHrP蛋白的表达与预后的相关性。[结果]一.裸鼠肺癌模型的建立1.移植肿瘤细胞的80只裸鼠,有76只发展为实质性肺癌(95%),肿瘤的病理切片中包含的多型性细胞异形性较大、分化较差,通过特殊标记物的免疫组织化学反应证实：注射A549细胞成瘤后裸鼠的肿瘤组织属腺癌,注射YTMLC-90细胞成瘤后裸鼠的肿瘤组织属鳞癌。2.免疫组织化学分析(IHC). Western Blot分析和实时荧光定量聚合酶链反应检测：荷瘤裸鼠肿瘤组织中PTHrP蛋白和PTHrPmRNA的表达较非荷瘤裸鼠肺组织中PTHrP蛋白和PTHrPmRNA的表达高。3.注射A549. YTMLC-90细胞后成瘤裸鼠的肿瘤负荷(肿瘤负荷的指标：肿瘤体积、肿瘤重量、肿瘤匀浆总蛋白含量、血清IL-8水平)：雄鼠大于雌鼠、注射睾酮的雌鼠大于注射生理盐水的雌鼠。二.肺癌细胞及其阳性对照细胞中ER, AR和PTHrPmRNA、PTHrP蛋白的表达1.A549、YTMLC-90细胞与其阳性对照细胞LNCaP、MCF7中ER-p、AR表达,ER-a不表达。2. A549、YTMLC-90细胞与其阳性对照细胞LNCaP、MCF7中PTHrPmRNA、 PTHrP蛋白表达。三.性激素调节PTHrP的分泌1. PTHrPmRNA在雌鼠中的表达高于其在雄鼠中的表达。2. PTHrPmRNA在注射睾酮雌鼠中的表达低于其在注射生理盐水雌鼠中的表达。3. PTHrP蛋白和PTHrPmRNA在女性肺癌组织中的表达高于其在男性肺癌组织中的表达。四.雄激素对PTHrP起负调节作用1.实验对照组B组、E组和空白对照组D组、F组：实验对照组中雄鼠(E组)的肿瘤总蛋白、血清IL-8水平大于雌鼠(B组)(P<0.05)；空白对照组雌(D组)、雄(F组)裸鼠的肿瘤总蛋白、血清IL-8水平接近零。2.实验组A组和安慰剂对照组C组：实验组血清中睾酮水平较对照组高、肺癌组织中PTHrP蛋白和PTHrPmRNA的表达较对照组低、肿瘤负荷较对照组大。3.分别用0.5nM. lnM、5nM、1OnM的17β-雌二醇和睾酮与A549、YTMLC-90细胞共同培养48小时,17β-雌二醇对A549、YTMLC-90细胞PTHrPmRNA的表达无影响,而睾酮却明显降低了A549、YTMLC-90细胞PTHrPmRNA的表达。五.肺癌患者PTHrP的表达与生存率之间的关系在NSCLC患者中PTHrP蛋白及PTHrPmRNA的表达在肿瘤组织中较高,在女性患者中较高。女性患者的预后与PTHrP蛋白的表达有关,PTHrP蛋白阳性者的预后更好：男性患者的预后与PTHrP蛋白的表达无关。[结论]1.雌激素对人A549肺腺癌细胞、YTMLC-90肺鳞癌细胞中PTHrPmRNA的表达无影响,雄激素下调其表达,起负调节作用。2.荷瘤裸鼠PTHrP蛋白及PTHrPmRNA的表达与其肿瘤负荷呈负相关关系,PTHrP蛋白及PTHrPmRNA的表达越高则肿瘤负荷越小,PTHrP蛋白及PTHrPmRNA的表达越低则肿瘤负荷越大。3.女性NSCLC患者的预后与PTHrP蛋白的水平有关,男性NSCLC患者的预后与PTHrP蛋白的水平无关。PTHrP蛋白阳性的女性患者,其预后比PTHrP蛋白阳性男性患者的预后好。PTHrP蛋白的表达可以作为女性NSCLC患者生存优势的一个预测指标。