论文部分内容阅读
由小麦叶锈菌(Puccinia triticina)引起的小麦叶锈病在世界各地产麦区均有发生。利用抗病品种是防治该病害最经济、安全、有效的方法。然而,由于叶锈菌毒性变异频繁,新的毒性小种不断出现,往往导致小麦品种抗锈性丧失,这已成为抗病品种应用中一个突出的问题。开展小麦与叶锈菌互作的分子机理研究,不但可以揭示病原物的致病机理和寄主植物的抗病机制,而且对小麦抗叶锈品种的合理利用及病害的可持续控制具有重要的理论和实际意义。本研究利用抑制差减杂交技术构建了叶锈菌诱导的小麦叶片cDNA文库和麦抗叶锈病近等基因系TcLr41和Thatcher之间的cDNA文库,对文库中序列进行了筛选,初步探明了叶锈菌诱导后48 h小麦的抗病相关基因表达情况,并对筛选到的抗病相关基因进行了克隆,为从分子水平阐明小麦的抗病机制奠定了基础。本论文主要包括以下几方面内容:1、本研究以Thatcher和以Thatcher为遗传背景的小麦抗叶锈病近等基因系TcLr41为材料,利用荧光显微技术,开展了小麦叶锈菌与寄主互作的组织病理学研究。结果表明:亲和反应与非亲和反应两过程之间在接菌24 h之内差异不大,而在接种后36 h在非亲和反应中出现早期的过敏性坏死反应与亲和反应完全不同;接种后48 h产生大量过敏性坏死反应抑制菌丝的生长;推测非亲和反应中接菌后48 h时可能是大量小麦抗叶锈病相关基因表达高峰时期,是寄主表现抗病性的关键时间点。2、以小麦抗叶锈病近等基因系TcLr41为材料,利用抑制差减杂交技术,成功构建了叶锈菌诱导的小麦叶片抑制差减杂交文库,共获得3,456个阳性克隆,同时也成功构建了一个包含2,544个阳性克隆的小麦抗叶锈病近等基因系TcLr41与Thatcher之间的抑制差减杂交文库。3、利用cDNA微阵列技术来筛选以小麦抗叶锈病近等基因系TcLr41和Thatcher为材料构建的两个抑制差减杂交文库,从而找到240个差异表达ESTs,其中137条为功能已知基因,这些基因包括谷胱甘肽-S-转移酶、促分化原活化蛋白激酶、WIR1蛋白、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶、脂转运蛋白、类奇(异果)甜蛋白、GTP结合蛋白、几丁质酶、钙结合蛋白等。4、利用荧光定量PCR技术检测六条抗病相关ESTs的表达情况,通过与cDNAmicroarray的结果进行比较发现,cDNA microarray与荧光定量PCR两种方法得到的结果基本一致。接种叶锈菌后抗病相关ESTs的表达情况表明,六条ESTs均在48 h时在TcLr41中的表达量高于在Thatcher中的表达量。5、利用RACE技术克隆得到3条抗病相关cDNA全长序列:BJ1.1A3、JD4.4E3和JD6.2D12。其中BJ1.1A3长1,636 bp,氨基酸多重比较发现与大麦中抗秆锈基因相似性为96%,可能编码小麦抗叶锈病相关基因:JD4.4E3与小麦中病原物诱导蛋白WIR1 mRNA相似性为98%;JD6.2D12全长cDNA基因为1,699 bp,其编码的蛋白与小麦中酪蛋白激酶Ⅱ同源性非常高。