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疯草是豆科棘豆属和黄芪属有毒植物的总称,是世界范围内危害草原畜牧业生产最严重的一类毒草,可导致中毒动物消瘦、神经症状、死亡,母畜不孕或流产、畸胎、死胎,公畜不育等,并给草原畜牧业生产造成了巨大损失。目前应用的防除方法主要包括人工挖除、化学灭除和生物防除等。这些方法的应用与实施对减少动物中毒所造成的损失产生了巨大的作用。但疯草在干旱年份和季节,生长更加旺盛,成为我国西部草场上的优势牧草,在固沙、保持草场生物量等方面具有较大潜力。其主要有毒生物碱成分——苦马豆素(swainsonine, SW)在医学研究和临床尤其是在抗癌方面的潜在应用价值的发现更引起人们的广泛关注,使疯草的防除与保护利用之间的矛盾日益突出。免疫学预防方法为解决这一矛盾展示了诱人的前景。但由于SW分子量小,不包含与BSA等蛋白载体连接的化学基团,其人工抗原的合成程序复杂。为了进一步简化合成程序,提高产率,增强人工抗原的免疫原性,本研究探索设计出2条SW人工抗原合成路线,建立了抗SW抗体的间接ELISA检测方法,通过免疫试验证明了合成的人工抗原的免疫原性。获得了如下结果:1.在超声提取的基础上,采用液-液萃取和升华结晶,自甘肃棘豆中提取SW,提取率达到45 mg/kg。2.依据芳香基可在紫外光下显示荧光的特性,以及具有芳香环结构的抗原免疫原性大于直链脂肪酸的特点,在半抗原与载体蛋白连接的“臂”中引入芳香基团,设计出2条新的合成路线,制备出SW人工抗原合成的关键中间产物。合成路线Ⅰ:首先将对氯甲基苯甲酸与碳酸钠或碳酸氢钠反应制备对氯甲基苯甲酸钠,然后和SW反应,合成氯化N-(4-羧基苯甲基)苦马豆素铵(N-(4-carboxybenzyl) swainsonine chloride,简称关键中间产物)。合成路线Ⅱ:酸性条件下,首先将对氯甲基苯甲酸与甲醇反应,生成对氯甲基苯甲酸甲酯,再与SW在有机溶剂中反应,生成氯化N-(4-羧酸甲酯基苯甲基)苦马豆素铵(N-(4-carboxymethylesterbenzyl) swainsonine chloride),再加入NaOH脱酯,继而调节反应体系至酸性,生成关键中间产物,最后通过柱层析分离纯化。通过MS、1H NMR和13C NMR等波谱的综合分析,鉴定合成产物的结构。结果证明设计的2条合成路线可行,能通过薄板层析与荧光检测并结合SW显色反应对合成的关键步骤进行即时检测。与合成路线Ⅰ相比,路线Ⅱ进一步减少了纯化过程,程序简单,提高了产物的均一性,关键中间产物的产率达到79%,适于大量制备。应用EDC法将合成的关键中间产物与BSA缩合连接,制备出SW人工抗原,按BSA计算,产率为95%,两次合成的人工抗原中SW与BSA的结合比分别为14.7:1和20∶1。3.用SW人工抗原(SW-BSA)免疫小鼠,制备抗SW血清,建立了一种敏感性高,特异性强,稳定性高的抗SW抗体间接ELISA检测方法,证明其最适条件为:以1.0μg?mL SW-OVA作为包被抗原,于4℃包被过夜或37℃包被2 h,封闭剂选用15 g/L的明胶,酶标抗体的工作浓度1:1500。4.应用制备的SW-BSA免疫小鼠和家兔,证明所制备的SW人工抗原具有良好的免疫原性,免疫后小鼠和家兔血清中针对SW的抗体ELISA效价均达到1:2000。上述结果为SW人工抗原疫苗的制备提供了新的途径,为生物样品中SW的含量测定以及相关研究奠定了基础。