论文部分内容阅读
目的:铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa，PA)，又称绿脓杆菌，属假单胞菌属，广泛分布于自然界、人体的皮肤、肠道和上呼吸道中，具有多重耐药性的特点，其分离率在非发酵菌中居于首位。铜绿假单胞菌是一种重要的条件致病菌，也是引起严重的医院内获得性感染的常见病原菌之一，如中性粒细胞减少症、严重烧伤或囊性纤维化，严重危害着人类的健康和生命。随着抗菌药物的广泛使用，抗菌耐药株的不断出现和传播，使得治疗方法越来越有限；结果，铜绿假单胞菌感染显示出高发病率和死亡率。因此，探讨铜绿假单胞菌的耐药机制，对于控制由铜绿假单胞菌引起的感染有重要的意义。双组分系统(two component system，TCS)广泛存在于铜绿假单胞菌中，文献报道在某些TCS的突变情况下，铜绿假单胞菌中的PA1797基因表达量比某些基因表达量都要大，如PA2572/PA2573，PA2572基因突变使PA1797基因升高56.2倍；CbrAB，CbrA基因突变使PA1797基因升高10.37倍；而在PhoPQ和ParRS突变中PA1797基因表达量相对较小。在Pseudomonas aeruginosa基因组数据库(www.pseudomonas.com)中，PA1797基因被定义为一个功能未知的新基因，目前有关PA1797基因的报道尚不多见，PA1797基因的功能尚不明确。本文采用抗生素敏感实验、绿脓素产量、杀菌、运动能力和生物膜培养等实验对PA1797基因的功能进行探讨。方法:（1） PCR扩增PA1797同源臂与四环素抗性基因插入自杀质粒pEX18-Tc，构建PA1797基因敲除载体，利用双亲杂交转化铜绿假单胞菌PAO1，构建PA1797基因突变株PCKH33。（2） PCR扩增PA1797－1基因编码片段，插入pJN105质粒阿拉伯糖诱导型启动子的下游，构建PA1797基因表达载体，转化PA1797基因突变株PCKH33，构建PA1797基因补偿株PCKH36。（3）通过抗生素敏感实验、运动实验、杀菌实验、绿脓素产量实验，观察野生株、突变株及补偿株变化。（4）用Trizol法抽提铜绿假单胞菌的总RNA，Real-time荧光定量PCR检测在PA1797基因突变情况下其他相关毒力基因表达情况。（5）生物膜培养，结晶紫染色后用荧光相差显微镜观察野生株、突变株及补偿株变化。结果：（1）经PCR及测序，证明铜绿假单胞菌突变株PCKH33中缺失PA1797基因，成功构建铜绿假单胞菌PA1797基因突变株PCKH33。（2）经PCR及测序，证明成功构建过表达质粒pJN105-PA1797-1和铜绿假单胞菌补偿株PCKH36。（3）与野生株相比较，突变株对美罗培南、头孢他啶和喹诺酮类的抑菌圈变小；泳动能力有明显区别；丧失杀菌能力；绿脓素产量减少。（4）与野生株相比较，突变株Ⅲ型分沁系统中的exoS基因相对表达量明显下降。（5）与野生株相比较，突变株4d后的生物膜明显减少。结论： PA1797在铜绿假单胞菌中发挥重要作用，参与并调节细菌的耐药性、杀菌作用、泳动作用和生物膜的形成。