TFDG制备及茶黄素对C2C12细胞分化作用研究

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茶黄素双没食子酸酯(Theaflavin-3,3′-digallate,TFDG)是红茶中由ECG和EGCG在多酚氧化酶的催化作用下缩合而成茶黄素类物质,不仅对红茶品质有重要影响,还具降血脂,降血压,抗氧化等多种生物学活性功效,在食品、保健品以及天然药物等领域具有广阔的运用前景。目前市场上总茶黄素制备主要采用儿茶素体外模拟氧化合成工艺,其原理与红茶加工过程类似,反应条件温和、反应底物均为食品级,是实现总茶黄素产业化制备的有效途径,其反应机理与条件筛选已经有较多的文献报道。但由于红茶中TFDG含量低且与其他茶黄素单体结构相似,无论是直接从红茶中或者从市售总茶黄素中分离得到高纯度TFDG的难度均较大,不能够满足食品医药领域研究的纯度与数量要求,鉴于本课题组目前对于茶叶儿茶素EGCG和ECG单体的纯化制备技术已经较成熟,成本相对可控,特选择直接应用两种儿茶素单体来进行TFDG的酶促合成研究,期望能够突破该领域产业制备瓶颈。另一方面,衰老和慢性疾病引发的肌肉减少症、恶病质等使病患体内成肌分化受到抑制,骨骼肌质量和力量丢失,严重降低病患生活质量。据报道,茶黄素可通过促进骨骼肌干细胞分化来增强骨骼肌性能的功效,但目前尚无研究对茶黄素促成肌分化活性进行系统研究,因此,本论文也初步进行了茶黄素混和物(总含量>57%)促成肌分化活性研究。主要结果为:1.体外模拟氧化催化EGCG和ECG合成TFDG,最佳反应条件为300 g皇冠梨匀浆催化摩尔比例为1:1的EGCG(1.55 g)和ECG(1.5 g)在37℃、通氧1 L·min-1、搅拌100 r·min-1的条件下反应40 min,在此反应条件下能够生成含量为36.34%的TFDG 0.61 g,产率为21%。2.本研究从6种常见大孔树脂中筛选出HP-20纯化TFDG效果较好,在使用树脂纯化两次后并进行初结晶,可制备得到含量为71%的TFDG。3.采用不同浓度茶黄素混和物干预小鼠骨骼肌成肌细胞(C2C12细胞)分化,统计分化成熟的肌管数量、长度和直径,并检测肌管分化标志因子My OG、My OD、My HC的m RNA表达,从细胞表型和基因表达水平两方面评估茶黄素促进成肌细胞分化活性的强弱。结果表明茶黄素混和物(TFs>57%)能够增强骨骼肌干细胞分化能力,显著改善细胞表面形态,降低其粘附力、刚度和杨氏模量等,且最佳作用浓度为5μM。
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