禾谷缢管蚜谷胱甘肽转移酶分子克隆和功能表达研究

来源 :西北农林科技大学 | 被引量 : 1次 | 上传用户:squallleo2009
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禾谷缢管蚜是小麦上的重要害虫,各小麦种植区均有发生,该虫危害可引起小麦大面积减产,造成重大经济损失。禾谷缢管蚜刺吸小麦汁液,并传播多种植物病毒,其中大麦黄矮病毒可造成小麦大面积受损,从而严重影响小麦产量和质量。当前农业生产生中麦蚜的防治主要依靠化学防治措施,多种杀虫剂被用于禾谷缢管蚜的田间防治。然而由于化学杀虫剂的长期、大量和不合理使用,该虫对部分药剂产生抗性或敏感性下降。谷胱甘肽S-转移酶(GST)是昆虫三大解毒酶之一,在昆虫抗性和抗氧化方面均起着重要作用。昆虫谷胱甘肽转移酶可分为六个亚家族(Delta、Epsilon、Omega、Sigma、Theta和Zeta),其中delta和epsilon亚家族为昆虫所独有。禾谷缢管蚜谷胱甘肽转移相关研究还未见报道,因此,本研究就禾谷缢管蚜GST开展一系列的工作,主要结果如下:1.不同化学农药对禾谷缢管蚜的毒性以及谷胱甘肽转移的活性响应我们测定了毒死蜱、吡虫啉、异丙威、氟啶虫胺腈、高效氯氟氰菊酯、氯氰菊酯和马拉硫磷对禾谷缢管蚜的毒性以及谷胱甘肽转移酶的活性变化。结果表明禾谷缢管蚜对不同杀虫剂的敏感性存在一定的差异,其中氯氰菊酯致死性最差,LC50为1.308 mg L-1,是异丙威的27.25倍。与对照组相比,氟啶虫胺腈和氯氰菊酯处理12和24小时后谷胱甘肽转移酶活性明显上调,马拉硫磷处理后12小时后GST活性也存在显著上调。结果表明GST活性上调不同杀虫剂的刺激存在相关性,以此同时,不同药剂对于禾谷缢管蚜的毒力差异也为大田用药提供了一定的科学依据。2.禾谷缢管蚜谷胱甘肽转移酶基因鉴定及原核表达我们通过克隆和基因测序,获得了11个禾谷缢管蚜GST基因,并着重关注omega、theta和sigma亚家族。分子克隆获得omega1、theta1、sigma1和sigma2进的全长。系统发育树分析表明禾谷缢管蚜谷胱甘肽转移酶omega、theta和sigma亚家族与其他昆虫各家族一一聚为一枝。结果分析表明禾谷缢管蚜GST蛋白有9个α螺旋和5个β折叠构成。omega和theta基因进行原核表达,并对表达单边进行纯化和功能分析。3.GST蛋白活性分析以CDNB和GSH为底物测定RpGSTO1和RpGSTT1蛋白活性。结果表明在最适PH条件下,Rp GSTO1和RpGSTT1蛋白酶动力学参数Km和Vmax分别为0.120和0.129 mM,2.906和1.426μmol/mg/mi。扩散实验结果表明RpGSTO1和RpGSTT1能够有效抵抗氢过氧化枯烯和百草枯引起的氧化应激。携带RpGSTO1和RpGSTT1基因的大肠杆菌菌斑受害较小。该研究表明GST在保护细胞抗氧化应激方面起着重要作用。4.禾谷缢管蚜omega,theta and sigma亚家族在不同农药选择压力下的表达模式我们对不同药剂刺激下禾谷缢管蚜theta、omega和sigma亚家族谷胱甘肽转移酶基因RNA水平表达进行分析。选择LC25和LC50两个浓度,毒死蜱、吡虫啉、异丙威、氟啶虫胺腈、高效氯氟氰菊酯、氯氰菊酯和马拉硫磷作为供试药剂。相对定量结果表明RpGSTO1、Rp GSTT1、RpGSTS1和RpGSTS2基因对于不同药剂的响应并不一致。结果表明谷胱甘肽转移酶参与了代谢抗性,而不同农药刺激下,GST基因表达模式的差异也可以从分子角度指导大田科学用药。我们首次对禾谷缢管蚜谷胱甘肽转移酶theta、omega和sigma亚家族进行了深入研究。研究结果表明GST在代谢杀虫剂和抗氧化方面重要作用。研究结果对于更好的阐述禾谷缢管蚜代谢抗性机制具有重要意义。研发谷胱甘肽转移酶抑制剂对于害虫农业防治具有重要作用。
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