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近些年来养殖业迅速的发展,养牛业作为养殖业主要产业之一,牛群的疾病引起了越来越多重视。其中牛呼吸道疾病综合征（Bovine respiratory disease complex,BRDC）,因为其病因复杂多变,难以应对,对全世界的养牛业都产生了巨大的经济损失。尽管有大量研究尝试治疗牛呼吸道疾病综合征,但是这些措施对减少牛呼吸道疾病综合征的影响作用有限,因此从根源找出该病发生的病因,从而对症治疗显的更为关键。国内外许多研究表明:牛呼吸道综合征病因既有DNA病毒又有RNA病毒,甚至还有支原体感染,其中牛疱疹病毒1型（Bovine herpes virus-1,BHV1）牛呼吸道合胞体病毒（Bovine respiratory syncytial virus,BRSV）牛冠状病（Bovine corona viruses,BCo V）、牛副流感病毒3型（Bovine parinfluenza-3 virus,BPIV3）、牛病毒性腹泻病毒（Bovine viral diarrhea virus,BVDV）、牛支原体（Mycoplasma Bovis,MB）是临床上几种常见的导致牛呼吸道综合征的病原,如果牛携带这些病原会导致牛呼吸道综合征的发生,引起牛发热、流鼻涕或肺炎,甚至死亡,给整个养牛场以至于养殖业的快速发展造成了巨大的阻碍。但是这些病原感染有着十分相似的临床症状,简单的临床观察难以具体辨别,并且这些病原感染常常以混合感染的形式出现,如果出现了混合感染情况,并对其相关的病原分别进行单独检测,不仅操作繁琐、消耗时间过长,还会出现检测结果不明显等缺陷。为了能快速的鉴别诊断牛呼吸道疾病综合征可能出现的多种病原感染或混合感染,本试验尝试构建一种可以快速同时鉴别BVDV、BPIV3、BRSV、BCo V、MB和BHV1的这六种病原体的六重PCR检测诊断方法,为牛呼吸疾病的预防和控制提供科学依据。主要研究方法和研究内容如下:1.牛呼吸道疾病综合征病原的BVDV、BPIV3、BRSV、BCo V、MB和BHV1单一PCR方法的建立及检测参照NCBI中发表的BVDV 5’-UTR（MK059454）、BPIV3 g N（JQ063064）、BRSV g N（AF188553）、BCo V g N（NC003045）、MB uvr C（AF003959）和BHV1 g B（AJ004801）等基因的高度保守序列,通过不同引物设计软件分析设计了6对PCR引物,通过对保守序列基因即BVDV 5’-UTR、BPIV3 g N、BCo V g N、BRSV g N、MB uvr C和BHV1 g B的序列进行扩增,扩增后能得到的目的基因片段大小分别为139 bp、239 bp、304 bp、456 bp、527 bp和798 bp。通过对阳性鼻拭子样品的检测、基因载体的构建和重组质粒的提取,获去重组质粒,并以其为模板对单一PCR反应条件进一步优化,构建了BVDV、BPIV3、BRSV、BCo V、MB和BHV1的单一PCR方法,为后续构建牛呼吸道综合征病原多重PCR方法的提供了有力的先决条件。单一病原PCR检测方法反应条件优化试验的结果显示:（1）单一PCR检测方法的最优反应体系:BVDV、BPIV3、BRSV和BCo V上游引物和下游引物浓度均为1.0μL,MB、BHV1上游引物和下游引物均浓度为1.5μL;分别相对应病原的质粒模板均为1μL;金牌Mix（green）补足25μL;即反应最佳体系为25μL体系。（2）单一PCR检测方法最优反应条件:BRSV、BCo V、BHV1和MB在退火温度54.1℃时条带最明显,即最优退火温度;BPIV3、BVDV在退火温度56.6℃出现了最明显条带,说明56.6℃为这个病毒的最优退火温度。（3）单一PCR检测方法的特异性和敏感性试验显示:试验构建的单一PCR检测方法可以对6种病原重组质粒的核酸模板检测量最低为2.2pg,具体各个病原可检测到的最低量分别为BVDV2.2 pg、BPIV3 3.2 pg、BRSV4.3 pg、BCo V 38 pg、MB 2.5pg、和BHV1 25pg,试验构建的牛呼吸道疾病综合征单一PCR检测方法对PBRSV和E.coli的检测结果均呈阴性,上述试验结构证明:成功构建了一种牛呼吸道疾病综的主要病原单一PCR快速诊断方法,该研究为临床牛呼吸道主要病原的流行病学调查的检测手段提供了一定的参考价值。对186份鼻拭子样品采用本试验构建的单一PCR检测方法对其中BVDV、BPIV3、BRSV、BCo V、MB和BHV1等6种常见病原PCR检测,在186份样品中BVDV的阳性检出率BVDV的阳性率最高,为16.13%（30/186）,而MB阳性检出率为12.90%（24/186）,BHV1阳性检出率为10.22%（19/186）,BCo V阳性检出率为10.22%（19/186）,BRSV阳性检出率为5.91%（11/186）和BPIV3阳性检出率为5.38%（10/186）;186份鼻拭子样本的单项PCR检测结果显示:出现了多种病原之间混合感染的情况。2.牛呼吸道疾病综合征病原六种常见病原多重PCR方法的构建在上述构建的BVDV、BPIV3、BRSV、BCo V、MB和BHV1目六种病原基因单一病原PCR检测方法的基础上,通过对BVDV、BPIV3、BRSV、BCo V、MB和BHV1六重PCR反应条件进行进一步的优化调整,改变模板和引物的浓度、用量和退火温度这些可控可调节的条件,同时BVDV、BPIV3、BRSV、BCo V、MB和BHV1六重PCR的特异性、敏感性和重复性进行了试验和研究。建立了一种同时检测BVDV、BPIV3、BRSV、BCo V、MB和BHV1六种牛呼吸道疾病常见病原的多重PCR检测方法。结果显示:（1）使用金牌Mix（green）补足50μL的反应体系是六重PCR最优反反应体系,BVDV、BPIV3、BRSV、BCo V和BHV1上游引物和下游引物浓度均为1μL;MB上游引物和下游引物均为浓度1.5μL,（2）在退火温度为54.1℃时多重PCR扩增基因条带最为明显,同时每个扩增的基因都出现特异性条带,即54.1℃为六重PCR最优退火温度;（3）上述可表明94℃5 min（预变性）;94℃45min（变性）,54.1℃45 s（退火）,72℃30 s（延伸）,35个循环;72℃15 min（延伸）是BVDV、BPIV3、BRSV、BCo V、MB和BHV1六重PCR的最优反应条件。（3）敏感性试验结果显示:建立的BVDV、BPIV3、BRSV、BCo V、MB和BHV1六重PCR对6种病原重组质粒的核酸模板检测量最低为44 pg,具体各个病原的最低检测量分别为BVDV 44 pg、BPIV3 32 pg、BRSV 43 pg、BCo V 76 pg、MB 75 pg和BHV1 125 pg。（4）特异性和重复性试验结果显示:BVDV、BPIV3、BRSV、BCo V、MB和BHV1六重PCR均同时能扩增出139 bp、239 bp、304 bp、456 bp、527 bp和798 bp六个条带,未能对PBRSV、E.coli和正常组织进行扩增,说明扩增结果为阴性。并且用BVDV、BPIV3、BRSV、BCo V、MB和BHV1六重PCR在不同时间段使用同样的步骤进行试验,5次结果均扩增出现相对应的条带。上述试验表明:成功建立一种同时检测牛呼吸道综合征的六种主要病原重PCR快速检测方法,可以使用试验建立的六重PCR进行临床鼻拭子样品的快速检测诊断以及后续的流行病学调查和牛群的防控。3.牛呼吸道疾病综合征病原多重PCR诊断方法的临床初步应用通过应用建立的牛呼吸道疾病综合征病原的多重PCR诊断方法对186份鼻拭子样品品检测的结果表明:贵州不同地区的存在不同程度的混合感染现象;在186份牛鼻拭子样品中未检测出五重感染和六重感染;六个牛场186份鼻拭子样品的混合感染率为9.14%（17/186）,其中BVDV+MB的二重感染阳性率为2.68%（5/186）,BVDV+BHV1的二重感染阳性率为1.61%（3/186）,MB+BHV1的二重感染阳性率为1.08%（2/186）,MB+BCo V的二重感染阳性率为1.61%（3/186）,BRSV+BPIV3的二重感染阳性率为1.08%（2/186）,BVDV+MB+BHV1的三重感染阳性率为0.54%（1/186）,BVDV+MB+BCo V的三重感染阳性率为0.54%（1/186）,BVDV+MB+BRSV+BPIV3的四重感染阳性率为0.54%（1/186）。通过与试验构建的单一PCR检测方法检测的结果对比,发现六重PCR检测方法检测的结果与单一PCR检测方法检测结果一致。通过对临床鼻拭子样品检测结果的对比,确定了本试验成功建立的一种能对牛呼吸道疾病综合征BVDV、BPIV3、BRSV、BCo V、MB和BHV1的六重PCR检测方法并且可以完成上述六种病原的同时检测,也能够对单个或混合感染的鼻拭子临床样本进行检测诊断。