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背景:大疱性类天疱疮(BP)是皮肤科常见的一种自身免疫性水疱病,病理特点为表皮下水疱,皮损有嗜酸性粒细胞、中性粒细胞等炎细胞浸润和基底膜带自身抗体和补体的沉积。自身反应性B细胞活化后产生针对真表皮基底膜带半桥粒抗原(BP180和BP230)的致病性自身抗体是BP发病的关键环节。目前认为在体液免疫中,自身抗体的产生依赖于B细胞受到抗原刺激后,在辅助性T细胞(Th)的辅助下发生活化、增殖,进而分化为浆细胞,从而合成多种免疫球蛋白(Ig)。在自身抗体产生的过程中,一方面B细胞表面受体(BCR)捕获抗原为B细胞活化提供了第一信号,另一方面Th细胞与B细胞的相互作用为B细胞的活化提供了必不可少的第二信号。与此同时,B细胞膜表面存在协同刺激分子,共同参与调控B细胞的活化。因此,探究影响B细胞活化的协同刺激分子,有助于深入解析B细胞活化和抗体生成的关键环节,对阐明BP发病机制并探讨新的治疗策略具有重要意义。CD100(Semaphorin 4D)属于信号素(Semaphorin)家族成员之一,是首个被发现具有免疫调节功能的信号素蛋白,为I型膜分子。CD100分子是一种细胞膜表面蛋白,全长150-kDa,可被多种蛋白水解酶剪切后从细胞膜表面脱落,形成120-kDa的游离型分子(sCD100),并且这种游离形式的CD100具有和膜型CD100同样的生物活性。CD100的受体包括CD72,Plexin-B1和Plexin-B2,其中CD72主要表达于B淋巴细胞表面。研究表明CD72是B淋巴细胞表面重要的负向协同刺激分子之一,可通过负向调控BCR信号抑制B淋巴细胞的活化和增殖。CD100与B细胞表面的CD72结合可“关闭”CD72对BCR的抑制信号,参与B细胞活化、增殖、分化和成熟。因此我们提出如下假说:BP患者血清及疱液中的sCD100可以通过作用于B细胞表面的负向协同刺激分子CD72,促进B细胞的活化、增殖和分化,进而促进致病性自身抗体产生,参与BP的发生与发展。目的:1.分析BP患者血清、疱液及局部皮损中CD100的表达情况,明确CD100与BP的相关性;2.明确CD100对BP患者致病性自身抗体产生的作用,并阐明其具体机制。方法:1.收集BP患者血清、疱液和皮损组织,利用ELISA、Western blot、免疫组化及组织免疫荧光技术检测CD100在BP患者血清、疱液及局部皮损中的表达情况。2.评估BP患者BPDAI评分,测定BP患者抗BP180及抗BP230的抗体滴度,作为反映患者病情活动性和严重程度的临床依据,进而与BP患者血清和疱液中的sCD100的浓度进行病情相关性分析。3.用不同浓度CD100重组蛋白刺激BP患者PBMC,于不同时间节点收集刺激后细胞培养上清,ELISA检测细胞培养上清抗BP180抗体滴度,筛选CD100重组蛋白刺激PBMC产生抗体的最佳浓度及刺激时间;在此基础上,用CD100重组蛋白最佳浓度刺激BP患者PBMC,于最佳刺激时间ELISA检测细胞培养上清抗BP180及抗体BP230抗体滴度,明确CD100对BP患者致病性自身抗体产生的作用。4.用CD100重组蛋白刺激BP患者PBMC,离心收集细胞沉淀,流式细胞术检测CD100刺激前后B细胞的分化情况;胞内细胞因子染色及流式细胞术筛选CD100刺激PBMC活化的下游通路;小分子通路抑制剂验证CD100活化B细胞的下游通路。5.收集BP患者PBMC、粒细胞、疱液细胞,流式细胞术检测不同细胞亚群膜表面CD100表达情况,明确BP患者游离型sCD100的细胞来源;使用不同蛋白水解酶处理粒细胞,明确剪切细胞膜表面CD100的蛋白水解酶,并使用蛋白水解酶特异性抑制剂验证其剪切功能。结果:1.BP患者血清和疱液中的sCD100水平较健康对照组显著升高,并与BP患者的疾病严重程度及活动性呈正相关;免疫组化、组织免疫荧光结果显示,BP患者表皮下水疱及真皮浅层血管周围有大量表达CD100嗜酸性粒细胞、中性粒细胞等炎细胞浸润。2.CD100重组蛋白可诱导BP180~+BP230~-的患者PBMC产生抗BP180抗体,诱导BP180~+BP230~+的患者PBMC产生抗BP180和BP230抗体,而CD100抗体可显著抑制CD100蛋白刺激PBMC产生致病性自身抗体。3.CD100重组蛋白通过Akt/NF-κB/Erk通路活化PBMC产生致病性自身抗体,Akt/NF-κB/Erk的小分子抑制剂可显著抑制CD100重组蛋白刺激PBMC产生致病性自身抗体。4.CD100重组蛋白可刺激PBMC中CD19~+CD138~-B细胞向CD19~+CD138~+浆母细胞分化。5.BP患者血清及疱液中高水平sCD100来源于ADAM10蛋白水解酶对CD15~+粒细胞膜表面CD100的剪切。结论:在BP发病过程中,ADAM10剪切BP患者CD15~+细胞表面CD100,是BP患者血清和疱液中高水平sCD100的重要来源。升高的sCD100通过与B细胞表面CD72结合,活化Akt/NF-κB/Erk信号通路,诱导CD19~+CD138~-初始B细胞向具备抗体分泌功能的CD19~+CD138~+浆母细胞分化,导致抗BP180及抗BP230抗体的产生,进而引发皮肤免疫损伤。我们的研究首次发现BP患者血清及疱液中存在高水平的sCD100,并且明确了sCD100来源于ADAM10对CD15~+粒细胞的剪切作用,证实了CD100参与BP致病性自身抗体的产生。研究结果丰富了BP致病性自身抗体产生的免疫学机制,为探索BP新的治疗策略提供理论基础。