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目的:在过去的几十年,有关疫苗的研发取得了很大的成绩,如经典的疫苗开发战略:减毒活疫苗、灭活疫苗、类毒素和亚单位疫苗。尽管这些战略已在多种细菌和病毒疫苗开发方面取得了很大成功,但在许多胞内寄生病原的疫苗开发上这些途径表现了很大的限制性。核酸疫苗的问世,以其多方面的优点如既可诱导体液免疫应答又能诱导细胞免疫应答;可编码多种抗原,从而构成多价疫苗;没有死疫苗灭活不全和活疫苗毒力恢复的风险;没有亚单位疫苗因蛋白纯化不够诱发异源性免疫应答的风险;设计简单,制备容易,花费较低;相对稳定,能耐受50℃温度,分送保存过程中不需冷冻系统等优点为疫苗的开发提供了一个新的途径。但是,经过10余年的研究,至今尚无临床可用的DNA疫苗可用于疾病的防治,重要原因在于DNA疫苗存在免疫保护作用不强的弱点。为克服DNA疫苗免疫保护差的弱点,我室和国内外众多研究者探索了多种措施包括采用不同的接种方式以提高宿主细胞的转染率;通过优化遗传密码或质粒的转录调节元件提高抗原的表达;与DNA疫苗接种同时应用编码树突状细胞特异性生长因子FLT3l、GM-CSF、MIP-1α的质粒以提高抗原提呈作用;同时应用编码IL-2、IL-12、IFN-γ等细胞因子增加T淋巴细胞的扩增以及应用不同的载体等以期提高其免疫保护作用,但均未达到预期效果。DNA疫苗诱导机体发生免疫应答的机制尚未完全明了。一般认为,DNA疫苗接种后,树突状细胞等专职抗原提呈细胞由于自身被转染,或通过其摄取体细胞表达的抗原及死亡的抗原表达细胞,产生、处理、加工抗原,并经MHC-I类、MHC-II类及交叉抗原提呈途径将抗原肽提呈给免疫活性细胞是其诱导免疫应答的主要机制。肌肉组织作为常用的接种部位,在DNA疫苗接种后可高效表达靶抗原,但由于作为非专职抗原提呈细胞的肌细胞缺乏B7.1、B7.2等共刺激分子的表达,其在DNA疫苗免疫中的作用众说纷纭。有报道认为,肌细胞作为非专职抗原提呈细胞在DNA疫苗免疫过程中可诱导免疫应答的产生,但更多的研究表明,肌细胞在此过程中导致的是免疫耐受而非免疫刺激,其机理可能涉及PD-L1/PD-1负性免疫调节通路的活化。鉴于上述以提高DNA疫苗免疫原性为目标的尝试未能取得满意的免疫效果,我们认为,换一个角度思考问题,阻断负性调节信号转导通路,有可能是解决DNA疫苗免疫效果不高的可行途径。基于上述考量,本研究以小鼠NOR-10细胞为研究对象,用不同的细胞因子处理细胞以模拟DNA疫苗接种后活化的T细胞与肌细胞相互作用的微环境,通过RT-PCR和流式细胞术检测细胞免疫相关的MHC-I、共刺激分子B7及负性免疫调节分子PD-L1的表达。探讨DNA疫苗肌肉注射接种后,肌细胞在免疫效应诱导过程中的可能作用及通过阻断负性调节信号PD-L1/PD-1通路提高DNA疫苗免疫效果的可能性。方法:⑴体外刺激细胞:NOR-10细胞以5×105的密度传到新的100ml培养瓶,24小时后,分别以干扰素-γ(IFN-γ,500U/ml)、白介素-4 (IL-4,50ng/ml),干扰素-β(IFN-β,500U/ml)刺激细胞,未处理细胞加新鲜培养基作为正常对照组。⑵Trizol提取细胞总RNA:不同的细胞因子处理细胞后,分别在3小时、6小时、12小时、24小时,48小时后提取细胞总RNA,未处理组作为正常细胞对照组,进行RT-PCR。⑶流式细胞术检测细胞表面蛋白:细胞用不同的细胞因子处理后,分别在12小时、24小时、48小时后收集细胞,未处理组细胞作为正常对照。收集1×106个细胞/每个样本。按流式细胞仪样本准备操作规程进行,然后上机检测。结果:⑴共抑制分子PD-L1的表达:证实正常小鼠NOR-10有少量的PD-L1mRNA但无PD-L1蛋白的表达。IFN-γ(500U/ml)和IFN-β(500U/ml)刺激既可上调PD-L1的mRNA表达,也可上调其蛋白的表达。⑵共刺激分子MHC-I的表达:正常的NOR-10细胞有少量的MHC-I mRNA表达,给予IFN-γ和IFN-β处理后,细胞MHC-I的mRNA均可被上调。正常细胞表面无MHC-I蛋白,IFN-β可诱导MHC-I分子表达,但IFN-γ刺激对MHC-I分子的表达不起作用。⑶共刺激分子B7的表达:正常情况下,培养的NOR-10细胞有少量B7.1 mRNA表达,但无B7.2 mRNA的表达,给予IFN-γ和IFN-β刺激后,B7.1mRNA表达量均没有明显变化,B7.2 mRNA仍然阴性。通过流式细胞术检测,我们发现细胞表面无B7.1和B7.2表达,同样给予IFN-γ,IFN-β和IL-4刺激后,仍检测不到B7.1和B7.2的表达。⑷IL-4刺激细胞,对PD-L1与MHC-I和B7.1、B7.2均没有影响。结论:⑴正常小鼠NOR-10细胞构成性表达PD-L1,MHC-I和B7.1 mRNA,但无B7.2 mRNA的表达;(2)正常的NOR-10细胞表面无MHC-I,共刺激分子B7.1、B7.2蛋白的表达,也无共抑制分子PD-L1蛋白的表达;(3)IFN-γ可上调PD-L1的mRNA和蛋白的表达水平,但对和B7.1和B7.2无影响。(4)MHC-I的mRNA可被IFN-γ上调,细胞表面蛋白不受影响。(5)IFN-β可使PD-L1、MHC-I的mRNA和蛋白表达均增高,对B7.1和B7.2没影响。(6)IL-4对MHC-I、B7.1以及PD-L1均无影响。