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血清和尿液中肌酐测定是临床评价肾小球滤过功能的重要指标,因而是临床上开展的重要生化项目之一。肌酐测定主要有化学法和酶法,这两种方法都是基于比色法。化学法主要源于Jeffe反应法,其优点是成本低,操作简单,易于基层单位开展,现在仍有很多基层医院在使用,但它的缺点也是明显的,即易受到样品中非特异性物质的干扰,也就是所谓的“假肌酐”。酶法则克服了上述缺点,无论是灵敏度还是特异性都有着化学法不可比拟的优势,但酶法测定肌酐也有自身的缺点。酶法所用的工具酶主要有三种(肌酐酶,EC 3.5.2.10;肌酸酶,EC 3.5.3.3;肌氨酸氧化酶,EC 1.5.3.1),肌酸酶是其中非常重要的一种,主要来源于微生物,但在我国目前尚不能自主生产。临床上肌酐酶学检测,主要使用进口原装试剂盒或者国内生物技术公司用进口工具酶组装的试剂盒,成本较化学法高出很多。国际临床化学联盟(International Federation ofClinical Chemists,IFCC)和我国临床检验中心(National Center for Clinical Laboratory,NCCL)推荐的肌酐测定方法是肌酐酶偶联肌氨酸氧化酶法,在这一大趋势下,开展具有完全自主知识产权的肌酐测定工具酶的研究具有特别重要的意义和良好的市场应用前景。主要的研究内容和结果:1.肌酸酶基因的克隆1.1肌酸酶基因部分序列的克隆查询GenBank上已发表的全部肌酸酶基因序列,从中选出7个不同种属来源的序列,将这7个序列递交到Block Maker服务器上进行块状比对,得到9个无间隙的保守区,再通过CODEHOP服务器运算,设计简并引物,以提取的烟草节杆菌02181基因组DNA为模板做简并PCR,得到一414 bp的片段,经在NCBI上BLASTx,与多种不同来源的肌酸酶有着高度的同源性,证实该序列为肌酸酶基因的部分序列。1.2肌酸酶基因全长序列的克隆根据已有结果,按照基因组步移技术要求设计该肌酸酶基因部分序列上、下游基因特异性引物GSP1、GSP2,利用这一技术分别克隆出已知序列的上、下游序列,利用BLASTx、Vector NTI suit 8、primer premier 5.0等工具软件拼接出肌酸酶基因的全长序列,该基因共有1254 bp(含有终止密码子),为一完整的开放读码框架(ORF),编码417个氨基酸,理论分子量为46377 Da。在NCBI上BLASTx结果显示,所得肌酸酶基因与多种不同来源的肌酸酶基因高度同源,其中同源性最高的为Arthrobacter sp.FB24来源的肌酸酶,其氨基酸序列的一致性为79%(332/417),同源性达到了87%(365/417),证明我们得到是一种全新的肌酸酶基因。在此基础之上,以该全长序列为模板,设计含有酶切位点及相应保护碱基的引物,其中,上游引物包含Eco RⅠ及EK酶(小肠激酶)的酶切位点,下游引物包含SalⅠ的酶切位点,以烟草节杆菌02181基因组DNA为模板,利用pfu酶克隆出含有酶切位点的肌酸酶基因,该基因全长1288 bp。经测序表明,所得序列与预期完全一致,证明我们克隆烟草节杆菌02181肌酸酶基因取得成功。2.肌酸酶在大肠杆菌BL21(DE3)中的表达与纯化用Eco RⅠ及SalⅠ分别双酶切PCR产物及pET42a质粒,经琼脂糖凝胶电泳并回收纯化后利用T4连接酶将该肌酸酶基因连入质粒pET42a,然后转化入大肠杆菌DH5α,酶切及测序以确认其正确性。将该重组质粒转化入大肠杆菌BL21(DE3)表达,经SDS-PAGE电泳,得到一种分子量约67 kDa的蛋白(带有GST标签,其分子量约为30 kDa),与预期完全相符。纯化过程中,我们利用EK酶将GST标签切割下来,经过第二轮GST纯化后,可得到纯度较高的不带有任何“外来”氨基酸的肌酸酶,经SDS-PAGE电泳,确定其单体分子量为46.4 kDa。经酶活性测定,每克湿菌可产生156.8 U的肌酸酶,与野生型烟草节杆菌每克湿菌产生10.7 U肌酸酶相比,产量提高了14.7倍,并且建立了重组肌酸酶的纯化工艺,纯化后的肌酸酶的比活性较纯化前提高了24.7倍。经纯化得到的肌酸酶在37℃时最适作用pH值为6.0,37℃时也很稳定,于40℃温育30 min后活性即开始下降,但在此温度下孵育60 min后酶活性再无明显降低,而在50℃下温育30 min后则活性完全丧失,从这些指标来看,已能满足临床应用的需要,为实现肌酐测定试剂盒的国产化奠定了良好的基础。