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研究背景与目的:动脉粥样硬化(AS)的发生机制存在多种假说,目前占主导地位的“损伤—反应假说”和“炎症说”认为,内皮细胞损伤、中膜平滑肌细胞迁移和增殖是AS发生的关键环节。内皮素(ET)是血管内皮细胞和平滑肌细胞分泌的血管活性收缩肽,在AS的发生发展中发挥着重要作用。已有研究明确,ET能够刺激平滑肌细胞增殖,然而,内膜损伤导致生成增多的ET反过来对内皮细胞有何损伤作用,目前尚不清楚,因此,本研究首先采用ET-1诱导损伤离体内皮细胞,探讨ET-1对人血管内皮细胞功能的影响。 由于蛇毒和ET具有共同的祖基因,蛇毒和ET-1分子结构极为相似,而且具有相似的生物学效应。1993年,张继峰等发现半边莲对ET-1、NE引起的保留内皮和去内皮血管环收缩均有剂量依赖的缓解作用。我室杜艳芝等曾对高脂血症大鼠灌服半边莲,定量分析其对动脉内皮的保护作用,发现半边莲生物碱(LCLAs)可使高脂血症大鼠内皮细胞的ET合成及释放减少,eNOS合成增加,减轻高脂血症对血管内皮的持续损伤。为了进一步探讨LCLAs对血管内皮细胞的保护作用机制,并进一步明确其有效成分,我们提取LCLAs,并同时应用其主要单体山梗菜碱,观察其对ET-1诱导损伤的人血管内皮细胞的作用,以为半边莲及其有效成分应用于临床治疗心脑血管疾病提供实验依据。 第一部分:内皮素对人血管内皮细胞基因表达谱的影响 方法: (1)CCK(细胞计数试剂盒)法确定建立细胞损伤模型的ET-1剂量:培养人血管内皮细胞ECV304至对数生长期,制成单细胞悬液,以4×10~1/ml的密度接种于96孔板,分组给药:ET-1终浓度为0.02μmol/L、0.1μmol/L和0.5μmol/L,分别作用6小时和24小时,并设不加ET-1的阴性对照。药物作用终止前2小时加入CCK工作液,继续培养2小时后,直接用酶标仪读取吸光密度(OD)值。根