目的针对巴西榥榥木这种研究信息较少的天然药材,本研究拟通过网络药理学、代谢组学和药理学实验相结合的方式,建立一种筛选其药效的实验模式,且为榥榥木后期的研究开发提供实验依据。方法1.通过建立巴西榥榥木的网络药理学来对其药理作用进行预测:基于雨林数据库(http://www.rain-tree.com/muirapuama.htm#.W67_VfZKI2w)及文献检索等方式,获得巴西榥榥木成分59种,获取其CAS号与名称,使用sciencefinder数据库检索59个化合物的结构,采用ACD/Lab Percepta软件将以上述各成分结构进行类药 性 分 析,根据 运 算 结 果 选 择 化合 物。利 用Swisstarget(http://www.swisstargetpredictio.ch/)数据库,依据分子的SMILES号进行查找相应靶点,将其下载为CSV格式并整理相关数据。以Probability>0.5为筛选条件,将满足条件的靶点与其对应成分进行保留。通过基因间相互作用的预测网站GeneMANIA(http://genemania.org/),将靶点信息导入其中,以此构建出PPI网络。对所建立的PPI网络,利用cytoscape软件中的mcode聚类分析模块,进行核心子网的推断和构建,利用子网中的靶点进行疾病的富集分析,根据富集分析结果预测相关的疾病。2.运用超高效液相色谱串联四极杆飞行时间质谱(UHPLC-Q-TOF-MS)技术,结合多变量数据分析,探究巴西榥榥木对正常大鼠血浆内源性代谢物的影响及其代谢机制。实验采用巴西榥榥木的高剂量5g/kg生药量、低剂量2.5g/kg生药量干预正常SD大鼠。在相同的饲养条件和给药条件下收集血清样本,利用UHPLC-Q-TOF-MS技术,将双蒸水对照组与巴西榥榥木给药组大鼠血清样品进行代谢轮廓分析。结合正交偏最小二乘判别分析法(OPLS-DA)与偏最小二乘法分析(PLS-DA)等多元统计分析方法,分析巴西榥榥木对正常大鼠代谢标志物的影响,并借助MetPA,分析药物对大鼠内源性代谢标志物代谢途径的影响,初步阐述巴西榥榥木的靶标范围。3.对巴西榥榥木醇提物展开急性毒理实验:观察小鼠给巴西榥榥木281.84g/kg后,1h、24h与7d的体态变化反应、体重变化及死亡状况。在此剂量下,小鼠未表现出毒性作用,可以初步认定巴西榥榥木基本没有毒性。按此剂量范围进行给药。在小鼠适应性负重游泳中,实验分为高剂量组(14g/kg生药量)、中剂量组(7g/kg生药量)、低剂量组(3.5g/kg生药量)三组,持续灌胃5天后,将小鼠放入恒温水中进行3天的给药负重游泳实验,其负重条件为小鼠体重的8%,从小鼠落入水中立即开始计时,至小鼠沉于水中,且10秒内不能自主上浮,这段时间为小鼠力竭时间。在第9天时,对给药后无负重游泳的小鼠摘眼球取血,同时取肝脏和肌肉待测,按试剂盒说明书测定小鼠肝脏匀浆中肝糖原含量、骨骼肌匀浆中肌糖原含量、血清乳酸、血清尿素氮含量与乳酸脱氢酶活性等指标。结果1.将巴西榥榥木成分对接相关靶点,根据靶点预测相关疾病,并分析疾病网络富集结果:基于检索等方式获得巴西榥榥木成分59种,根据化合物的结构,采用ACD/Lab Percepta软件分析化合物的类药性分析,将结构导入进行运算,最后导出类药性分析结果,根据结果选择具有类药性的化合物。利用Swisstarget数据库,依据分子的SMILES号进行查找相应靶点,其主要靶点为Tyrosyl-DNA phosphodiesterase 1、Muscleblind-like protein 3、Muscleblind-like protein 1、5-anhydro-D-fructose reductase等67种相应靶点。通过建立的PPI网络,利用cytoscape软件中的mcode聚类分析模块,进行核心子网的推断和构建,利用子网中的靶点进行疾病的富集分析,可以得到Digestive System Diseases、Neoplasms、Neoplasms by Site、Skin and Connective Tissue Diseases、Pathological Conditions,Signs and Symptoms 等 41 种相关疾病。2.巴西榥榥木乙醇提取物对正常大鼠的给药后血清代谢组学代谢分析:血清代谢组学稳定性分析结果表明,高剂量给药组大鼠的内源性代谢物更加稳定。低剂量组差异更大。在代谢组学研究中,经过血清代谢物检索后,富集并分析差异代谢物的代谢通路,得到30个有意义的代谢通路:β-丙氨酸代谢、丙酸盐代谢、酮体的合成与降解、类固醇合成、花生四烯酸代谢和柠檬酸循环等。3.通过对巴西榥榥木醇提物展开急性毒理实验,结果证实,巴西榥榥木醇提物的灌胃给药最大耐受量为281.84g生药/kg;并进行小鼠的负重游泳实验,结果显示与给双蒸水的空白对照组相比,巴西榥榥木乙醇提物给药组的小鼠,负重游泳时间相对更长且具有显著差异性,其中中剂量组和低剂量组能显著减少力竭游泳后小鼠血清中乳酸含量、增加乳酸脱氢酶的活性,且中剂量组血清尿素氮含量显著减少。结论1.通过网络药理学对其药理作用进行分析预测:巴西榥榥木主要成分所对应的靶点主要为雄/雌激素类受体、肌类蛋白、脂蛋白受体、活化肽片段等。根据靶点初步推测,巴西榥榥木可能在能量代谢、性功能、脂存贮等方面有一定的药理作用;根据靶点相关疾病的分析结果,巴西榥榥木可能对于消化系统疾病、肿瘤、肝硬化、呼吸道疾病等有一定的治疗作用。2.依据代谢标志物变量的显著性和变化强度,初步筛选代谢标志物变量49个进行定性分析,通过差异代谢物的代谢通路富集,分析得到30个有意义的代谢通路,其中主要可以分为能量代谢、激素类作用、脂类的合成与代谢、氨基酸类代谢四种类型的代谢途径。其中大多直接或者间接参与能量代谢。因此可以说明,巴西榥榥木能够影响大鼠的能量的代谢、氨基酸代谢、脂类物质的代谢、激素合成等。基于血清代谢组学分析,榥榥木参与大鼠体内多条代谢通路,为后期的药效学实验提供可参考的研究方向,为巴西榥榥木的未来开发利用提供科学依据。3.巴西榥榥木的毒性实验结果证明了巴西榥榥木的安全性,为后期给药方案提供了一个剂量范围;小鼠力竭性游泳后,其体内能源物质的耗竭和某些代谢产物的增加。例如:ATP的储量下降,血糖的显著性消耗。这些代谢物的变化,可引起中枢性疲劳。抗疲劳作用实验结果证明,巴西榥榥木醇提物在一定剂量范围内,具有的抗疲劳作用,经典药理学的实验结果与网络药理学与代谢组学预测的结果一致。