活性维生素D3及其受体对人系膜细胞中mTOR蛋白表达的影响

来源 :石河子大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:cenyizhon
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目的:探讨活性维生素D3[1,25(OH)2D3]及其受体对体外培养的人肾小球系膜细胞增殖、细胞周期、凋亡及对人肾小球系膜细胞中mTOR蛋白表达的影响,初步探讨1,25(OH)2D3及其受体通过PI3K/Akt/mTOR信号通路对人肾小球系膜细胞的调节作用。方法:(1)体外培养人肾小球系膜细胞,随机分为正常对照组、EGF(10ng/ml)组、1,25(OH)2D3(10-8mol/L)组、EGF联合1,25(OH)2D3组,通过倒置相差显微镜观察各组干预48h后对人肾小球系膜细胞形态与生长的影响(2)采用CCK-8法检测各组干预48h后对人肾小球系膜细胞增殖的影响(3)通过流式细胞术检测各组干预48h后对人肾小球系膜细胞细胞周期的影响(4)TUNEL法检测各组干预48h后对人肾小球系膜细胞细胞凋亡的影响(5)RT-PCR检测各组干预48h后对人肾小球系膜细胞中mTORmRNA、nVDRmRNA表达的影响(6)采用western-blot法检测各组干预48h后人肾小球系膜细胞中mTOR、nVDR蛋白的表达情况。结果:(1)倒置相差显微镜下观察人肾小球系膜细胞形态,正常对照组细胞胞体呈梭形,胞核居中,圆形或卵圆形,可见树枝状突起,部分突起相互融合成网格形;与正常对照组比较,EGF组细胞生长增快,细胞体积增大,细胞核增大,可见双核细胞,1,25(OH)2D3组细胞的生长被显著抑制,表现为细胞皱缩,体积变小,核浓缩成点状,胞浆浓缩甚至出现空泡,EGF联合1,25(OH)2D3组细胞生长状况欠佳,细胞呈梭形,细胞质的折光性欠佳,细胞核体积略小,胞质中可见少量空泡形成(2)CCK-8法检测人肾小球系膜细胞增殖:与正常对照组相比,EGF组能显著促进人肾小球系膜细胞的增殖,差异有统计学意义(P<0.01),1,25(OH)2D3组能显著抑制人肾小球系膜细胞增殖,差异有统计学意义(P<0.01),EGF联合1,25(OH)2D3组对人肾小球系膜细胞的增殖无明显抑制或促进作用(P>0.05);与EGF组相比,EGF联合1,25(OH)2D3组均能显著抑制人肾小球系膜细胞的增殖,差异有统计学意义(P<0.01)。(3)流式细胞术检测人肾小球系膜细胞细胞周期:与正常对照组相比,EGF组G1期细胞显著减少,S期细胞显著增多,差异有统计学意义(P<0.01),1,25(OH)2D3组G1期细胞显著增多,S期显著减少,差异有统计学意义(P<0.01),EGF联合1,25(OH)2D3组G1期、S期细胞均无显著性变化(P>0.05);与EGF组相比,EGF联合1,25(OH)2D3组G1期细胞显著增多,S期细胞显著减少,差异有统计学意义(P<0.01)。(4)TUNEL法检测人肾小球系膜细胞凋亡:与正常对照组相比,EGF组人肾小球系膜细胞的凋亡率显著降低,差异有统计学意义(P<0.01),1,25(OH)2D3组人肾小球系膜细胞的凋亡率显著增加,差异有统计学意义(P<0.01),EGF联合1,25(OH)2D3组人肾小球系膜细胞凋亡率无显著性变化(P>0.05);与EGF组相比,EGF联合1,25(OH)2D3组人肾小球系膜细胞凋亡率显著增加(P<0.01)。(5)RT-PCR检测人肾小球系膜细胞中mTORmRNA的表达:与正常对照组相比,EGF组人肾小球系膜细胞中mTORmRNA的表达显著增加,差异有统计学意义(P<0.01),1,25(OH)2D3组人肾小球系膜细胞中mTORmRNA的表达显著降低,差异有统计学意义(P<0.01),EGF联合1,25(OH)2D3组人肾小球系膜细中mTORmRNA的表达无显著性变化(P>0.05);与EGF组相比,EGF联合1,25(OH)2D3组人肾小球系膜细胞中mTORmRNA的表达显著降低,差异有统计学意义(P<0.01);(6)RT-PCR检测人肾小球系膜细胞中nVDRmRNA的表达:各实验组均未见nVDRmRNA的表达。(7)western-blot检测人肾小球系膜细胞中mTOR的表达:与正常对照组相比,EGF组人肾小球系膜细胞中mTOR蛋白的表达显著增加,差异有统计学意义(P<0.01),1,25(OH)2D3组人肾小球系膜细胞中mTOR蛋白的表达显著减少,差异有统计学意义(P<0.01),EGF联合1,25(OH)2D3组人肾小球系膜细胞中mTOR蛋白的表达无显著性变化(P>0.05);与EGF组比较,EGF联合1,25(OH)2D3组人肾小球系膜细胞中mTOR蛋白的表达显著降低,差异有统计学意义(P<0.01)。(8)western-blot检测人肾小球系膜细胞中nVDR的表达:各实验组均未见VDR的表达。结论:(1)1,25(OH)2D3可抑制人肾小球系膜细胞的增殖,诱导人肾小球系膜细胞的凋亡。(2)EGF可促进人肾小球系膜细胞的增殖,抑制人肾小球系膜细胞的凋亡,这种作用可被1,25(OH)2D3显著抑制。(3)1,25(OH)2D3可抑制人肾小球系膜细胞中mTORmRNA、mTOR蛋白的表达
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