目的:肺癌是全球发病率最高且最具侵袭性的恶性肿瘤之一。非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer,NSCLC）约占肺癌患者的80-85%,死亡率极高。晚期多发转移的NSCLC很难治愈,5年生存率仅为1-2%。转移是NSCLC预后不良的主要原因之一,常见远处转移部位包括脑、肝脏、脊椎以及肾上腺等。如何控制晚期NSCLC的转移是治疗成功与否的关键。自表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂（EGFR-TKI）的问世以来,绝大多数预后差死亡率高的EGFR突变阳性的NSCLC患者已经从中获益。但是,治疗过程中获得性耐药的出现严重影响了疗效,增加了肿瘤复发转移的机会。EGFR-TKI常见的耐药机制包括:T790M、C797S等基因的二次突变;K-RAS突变、PTEN缺失引起的下游通路变异;Met、IGF-1R等旁路信号激活以及EGFR-TKI介导的凋亡途径的损伤等。目前对EGFR-TKIs耐药机制的研究主要集中在增殖能力的提高和凋亡程度的降低,很少有研究关注耐药细胞转移能力的变化以及耐药相关基因对其转移能力的影响。然而大多数被诊断为EGFR-TKI耐药的患者频繁出现肿瘤转移的现象,现有研究也显示化疗和靶向药耐药的肿瘤细胞易发生EMT最终获得更强的转移能力。因此研究EGFR-TKI耐药后肿瘤是否更容易发生转移,特别是耐药后转移相关的潜在机制是必要且具有重要意义的。整合素是由α亚基和β亚基组成的异源二聚体家族,是介导细胞之间及细胞与细胞外基质机械粘附的细胞表面跨膜蛋白受体。整合素家族不仅参与细胞的生长、分化、增殖、凋亡等生命过程,更能促进肿瘤细胞的迁移及侵袭,并向转移的肿瘤细胞传递信号以确保它们在适当的位置定植并开始生长。现有研究报道Integrinα5在肺癌转移的淋巴结组织中高表达;integrinβ3的缺失增加肺癌细胞对传统化疗药物的敏感性。另有研究表明integrinβ1和integrinβ3的高表达可促进肺癌细胞对EGFRTKI的耐药。然而,整合素对TKI耐药肿瘤细胞迁移和侵袭的影响尚不清楚。既往研究显示,整合素家族在不同非小细胞肺癌患者中表达存在差异,功能也不尽相同,我们推测这种差异表达和肿瘤异质性可能影响患者预后。因此,我们希望通过公共数据库的患者进行生存分析,寻找到整合素中影响预后的关键分子,并构建生存预测模型,为整合素分子发挥临床价值提供思路。在本研究中,我们建立了稳定的埃克替尼耐药的NSCLC细胞系,与亲本细胞相比耐药细胞转移能力明显增强。通过全转录组测序和在线生信分析,筛选出在耐药细胞中上调的integrinα5作为靶基因。敲减integrinα5后,耐药细胞迁移及侵袭能力明显下降。敲减integrinα5后联用埃克替尼,耐药细胞转移能力被抑制最明显,但联用只能部分逆转埃克替尼耐药。敲减integrinα5后,FAK、STAT3、AKT的磷酸化蛋白水平明显下调,提示integrinα5通过FAK-STAT3/AKT信号通路在耐药细胞中发挥关键作用。基于整合素家族,利用TCGA肺腺癌数据分析筛选出对肺腺癌预后起到关键作用的分子ITGA5,ITGA6,ITGAL。构建影响肺腺癌预后的特异性3-整合素预测模型并进行验证,用于精准评估肺腺癌患者预后。方法:1.MTT实验检测细胞增殖能力。2.集落形成实验检测细胞克隆形成能力。3.划痕实验检测细胞迁移能力。4.Transwell实验检测细胞迁移和侵袭能力。5.Western blot实验检测细胞的integrinα5,integrinβ4,p-FAK,FAK,p-STAT3,STAT3,p-SRC,SRC,p-ERK,ERK,p-AKT,AKT,p-ERK,ERK,actin蛋白表达。6.si RNA转染细胞敲减integrinα5。7.生信分析及全转录组测序:Illumina Human HT12 v3 Bead Chip进行基因表达芯片分析;下载来自GEO数据集并用GEO2R分析获得差异表达基因;KEGG进行通路富集分析。8.TCGA数据库中下载肺腺癌数据,并将探针名进行转换,并于临床信息进行匹配。9.单因素及多因素COX回归用于寻找可能影响预后的关键分子,并利用多因素COX回归的结果,根据回归系数构建模型。10.利用ROC曲线评价新模型与经典模型的优劣,并分析新模型与临床病理学参数之间的关系。11.统计学分析:所有实验重复3次,结果用均值±标准差表示。应用SPSS 16.0进行统计分析,T检验及One-way ANOVA用于组间比较,p<0.05具有统计学意义。结果:1.埃克替尼耐药细胞系PC9/Ico R和827/Ico R对埃克替尼耐药。将亲本细胞PC9和HCC827暴露于埃克替尼中并逐渐增加药物浓度,最终建立终浓度分别为10μmol/l和5μmol/l的耐药细胞系PC9/Ico R和827/Ico R。48h MTT结果显示,埃克替尼对亲本细胞的增殖抑制作用呈剂量依赖性,而对耐药细胞增殖能力无明显影响。集落形成实验也得到类似的结果:埃克替尼对耐药细胞的集落形成没有明显抑制作用。而24小时MTT结果显示:短时间药物作用对亲本和耐药细胞均没有明显生存抑制作用。这些结果证实了埃克替尼不能抑制耐药细胞增殖,即我们建立了稳定的耐药细胞系。2.耐药细胞的迁移和侵袭能力比亲本细胞增强。划痕实验结果显示耐药细胞827/Ico R和PC9/Ico R的迁移速度比亲本细胞的迁移速度快,埃克替尼处理能够抑制亲本细胞迁移,但对耐药细胞没有明显影响。Transwell结果表明,827/Ico R和PC9/Ico R细胞通过小室滤膜或基质胶的数量明显多于HCC827和PC9细胞。同样,埃克替尼处理只能减少亲本细胞的迁移和侵袭,但对耐药细胞影响不明显。以上这些结果表明:与亲本细胞相比耐药细胞的迁移和侵袭能力明显增强,而埃克替尼只能抑制亲本细胞的迁移和侵袭能力,对耐药细胞的转移能力几乎没有影响。3.integrinα5在埃克替尼耐药细胞中表达增加。为明确耐药细胞迁移和侵袭能力增强的原因,我们首先研究细胞的基因芯片筛选得到在PC9/Ico R细胞中较PC9细胞上调的基因,并用KEGG通路富集分析得到排名前20位的通路并筛选得到与转移相关的Focal adhesion和ECM-receptor interaction通路。利用GEO数据库中的芯片数据集GSE62504,下载EGFR突变的NSCLC细胞系HCC827及HCC827/BR的基因芯片数据,并用KEGG富集分析差异基因得到黏着斑通路。将以上3条通路做交集并在其中筛取出我们感兴趣的整合素家族基因integrinα5和integrinβ4。Western blot进一步验证上述结果:integrinα5在耐药细胞827/Ico R和PC9/Ico R中的蛋白表达水平分别较亲本细胞HCC827和PC9上调。而integrinβ4的表达水平仅在PC9/Ico R耐药细胞中上调,而在827/Ico R耐药细胞中下调。鉴于上述结果,integrinα5可能在埃克替尼耐药细胞系中发挥关键作用。4.integrinα5促进埃克替尼耐药细胞的迁移和耐药。Western blot结果显示:与NC相比,用si RNA（序列1和序列2）转染耐药细胞827/Ico R和PC9/Ico R敲减integrinα5后,integrinα5蛋白的表达几乎完全被抑制。Transwell实验结果显示:与NC相比,敲减integrinα5后的827/Ico R和PC9/Ico R细胞穿过滤膜的数量明显减少。当敲减integrinα5后联用埃克替尼,耐药细胞的迁移能力下降最明显。除此之外,MTT结果显示:敲减integrinα5仅可以部分恢复耐药细胞827/Ico R和PC9/Ico R对埃克替尼的敏感性。5.integrinα5通过FAK/STAT3/AKT通路促进埃克替尼耐药细胞的迁移。为了进一步阐明integrinα5在耐药细胞转移过程中的作用机制,我们用Western blot检测integrinα5的下游途径。结果显示:p-FAK、p-STAT3、p-AKT和p-ERK在耐药细胞PC9/Ico R和827/Ico R中的蛋白水平远高于亲本细胞PC9和HCC827。当用埃克替尼作用于亲本细胞后,p-FAK、p-STAT3和p-AKT的蛋白水平显著下调,而埃克替尼处理的耐药细胞中p-FAK、p-STAT3和p-AKT的蛋白水平没有明显变化,这与transwell迁移实验结果一致。用si RNA敲除耐药细胞中integrinα5后,p-FAK、pSTAT3和p-AKT的蛋白表达水平明显下降。用STAT3抑制剂stattic作用于耐药细胞后,p-STAT3,p-AKT蛋白水平均明显下调,而p-FAK蛋白水平无明显变化。以上结果强烈提示integrinα5/FAK/STAT3/AKT信号通路在埃克替尼耐药细胞中起重要作用。6.AKT活化促进埃克替尼耐药细胞的迁移。为验证下游AKT在耐药细胞中对转移的影响,分别用埃克替尼、AKT抑制剂LY294002及两者联合作用于PC9/Ico R细胞。分别用Western blot检测p-AKT蛋白水平的变化,用transwell迁移实验检测细胞迁移能力的变化。Western blot结果示:当埃克替尼单独作用时,p-AKT蛋白水平未见明显变化;当LY294002作用时,p-AKT蛋白表达下调;当埃克替尼与LY294002联用时,p-AKT蛋白表达下降最明显。Transwell迁移实验结果显示:当埃克替尼单独作用时,穿过小室滤膜细胞的数量无明显变化;LY294002单独作用时,迁移细胞数量明显减少;当两药联合作用时,细胞迁移能力被抑制最为明显。以上结果提示:下游AKT活化促进埃克替尼耐药细胞的迁移。7.TCGA数据库中332例肺腺癌患者的转录组测序结果显示,整合素家族基因表达存在明显个体差异,进一步利用单因素及多因素COX回归,筛选出关键整合素分子ITGA5,ITGA6,ITGAL。8.利用回归系数构建风险评分模型,根据最佳Cut-off值将所有样本分为高表达组及低表达组,Kaplan-Meier生存分析显示两组生存时间存在显著差异。并且风险评分高的患者T分期、N分期、M分期均较晚。9.T分期+N分期+RS评分无论在短期或长期随访中均具有较好的预测价值,1年,3年,5年的时间依赖性ROC曲线的AUC值分别为0.735,0.731,0.741,均高于经典评价模型。结论:1.埃克替尼耐药的NSCLC细胞转移能力较亲本细胞明显增强。2.integrinα5的上调显著促进埃克替尼耐药NSCLC细胞的迁移及侵袭,但对促进耐药细胞增殖的作用不明显。3.integrinα5通过FAK/STAT3/AKT通路促进埃克替尼耐药NSCLC细胞的转移。4.ITGA5,ITGA6和ITGAL与肺腺癌预后显著相关,以它们为基础建立的整合素家族特异3-基因模型可以有效预测肺腺癌患者的预后。5.T分期+N分期+RS危险评分模型具有潜在的肺腺癌预后预测价值,可为临床诊断提供帮助。