目的:对患者特异性诱导的多能干细胞（iPSC,induced pluripotent stem cell）的基因编辑一直以来是临床细胞基因治疗的重要课题。CRISPR-Cas9（clustered regularly interspaced short palindromic repeats-CRISPR associated protein 9）基因编辑技术是基因敲除（KO,knock-out）有力工具,但是对同源重组指导修复（HDR,homology directed repair）介导的精确基因敲入（KI,knock-in）仍缺乏细致研究。因此,我们期望研究CRISPR-Cas9基因编辑后造成的细胞（尤其是具有临床应用价值的细胞类型）基因组DNA双链断裂（DSB,double strand break）的具体修复细节和规律,从而提高基因编辑效率、尤其是HDR介导的精确基因KI的效率。此外,通过优化HDR模版,在保证精确基因KI高效率的基础上提高KI报告基因的表达水平。方法:首先我们设计了针对多个基因打靶不同位置的sgRNA（single-guide RNA）。这些sgRNA本身的序列特征具有多样性:带有强烈的NHEJ（Non-homologousend joining,非同源末端连接）或 MMEJ（Microhomology-mediated end joining,微同源末端连接）倾向。购买商品化 crRNA（CRISPRRNA）,与 tracrRNA（trans-activating crispr RNA）退火形成gRNA。gRNA与Cas9蛋白室温孵育可以自发形成具有电转稳定性的RNP（ribonucleoprotein,核糖核蛋白）复合物。我们将培养状态良好的iPSC或其他细胞系进行RNP电转,根据实验需要加入AAV6 HDR模版或小分子化合物,在不同时间点收集细胞,提取细胞基因组DNA（gDNA）对打靶位点进行PCR扩增后lllumina高通量测序。数据处理分析后形成详细的可视化结果,包括总编辑效率、各修复结果及其比例。除了 RNP和AAV之外,我们还用质粒递送系统和课题组之前开发的双切模版载体KI荧光蛋白报告基因,通过流式细胞术检测荧光蛋白的阳性比例和表达强度。结果:我们在几种细胞类型中比较了多个基因位点的编辑效率,发现同种细胞中不同的基因位点、或者同一基因位点在不同的细胞类型中的编辑效率都存在差异。参考这些打靶基因在各种细胞类型中的TPM（Transcripts per million,RNA-seq每百万reads转录本）值,我们发现转录活跃基因（TPM值高）的编辑效率明显高于TPM值几乎为零的非转录活跃基因。我们比较分析了 CRISPR-Cas9 RNP基因编辑后各个DNA修复情况的T50,并以此表示各种修复方式的速度。我们发现NHEJ+1（特别是NHEJ+A/T）的T50值最小,HDR的T50值介于NHEJ和MMEJ两者之间,MMEJ的T50值较大。其中,MMEJ介导的较短删除发生快于中等长度删除;-10bp以上较长的删除T50值最大。这是首次对CRISPR-Cas9RNP编辑后各种经典DNA修复结果的详细动力学规律的探索和展示。当AAV6HDR模版存在时,MMEJ相对频率明显降低;加入NHEJ抑制剂小分子后,NHEJ的相对比例大幅度降低而HDR效率显著提高。我们的结果第一次揭示了这三种经典DNA修复途径的竞争关系,并且利用强效小分子NHEJ抑制剂提高了在iPSC等临床相关细胞类型的HDR精确基因KI效率。许多内含子被证实含有近段或远端增强子等顺势元件的调控序列特征。利用我们新开发的内含子保留型和人工替换的天然内含子HDR模版,提高了 KI报告基因的表达水平。结论:1.在多种细胞类型中,转录活跃的基因更容易被编辑;2.sgRNA的序列本身很大程度上决定了 CRISPR-Cas9基因编辑的效率和编辑后的DNA修复方式。若PAM前第4位的碱基是A或T,则该编辑往往会造成NHEJ+A/T倾向性极高的编辑结果;3.CRISPR-Cas9造成细胞DSB之后,三种主要的DNA修复方式的动力学特点不同:发生速度NHEJ＞HDR＞MMEJ;4.利用组蛋白去乙酰化抑制剂或强效的NHEJ抑制剂等小分子药物可以有效提高基因编辑效率,特别是HDR效率。M3814抑制快速发生的NHEJ,提高HDR效率;5.使用带有人工内含子的HDR模版,尤其是带有增强子元件的内含子,显着提高了 iPSC中报告基因的表达水平。