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近年来,随着社会发展,人们生活水平的提高,血管疾病的发病率和致死率逐年上升,成为威胁人类健康的重要风险因素.血管疾病包括动脉粥样硬化、炎症性血管疾病及功能性血管疾病等.本课题主要研究了机体出血和腹主动脉瘤的预防治疗措施. 医院,战场以及急救过程中,不可控的大规模出血极易引发死亡.然而,目前临床还没有安全有效的止血特效药.本课题组设计了一种安全有效、易储存且成本低廉的正电荷纳米止血剂.纳米止血剂由不同的胆酸与多种聚乙烯亚胺(PEIs)自组装合成.体外实验表明自组装纳米止血剂可以激活血小板从而促进血小板的聚集.局部应用或静脉注射纳米止血剂溶液可以减少啮齿类动物模型损伤部位的出血时间. 腹主动脉瘤(AAA)在老年人中死亡率较高,近年来呈现年轻化趋势.至今仍没有安全有效的药物可以预防AAA的发生发展以及血管的破裂.因此,本课题组根据AAA的病理机制设计了一种活性氧(ROS)响应性的纳米载药系统.该纳米载药系统可以靶向到AAA血管损伤部位达到治疗效果.纳米药物用环肽配体(cRGDfk)修饰后可以增强主动靶向性,提高炎症微环境响应性纳米药物的治疗效果.这种cRGDfk修饰的主动靶向纳米药物在经过细胞膜包裹后可以通过同源靶向更有效的传递药物分子雷帕霉素(RAP)到AAA血管局部,高效的抑制腹主动脉瘤的膨胀破裂. 1.自组装纳米止血剂的制备与表征 不同类型的胆酸与多种聚合物(PEIs)按设定的质量比溶解在二甲基亚砜(DMSO)中.混合溶液在去离子水中透析,每两小时换一次透析液.透析24h后,收集样品. 荧光染料7.5(Cy7.5)或荧光染料5(Cy5)标记的分子量为25kDa的分枝状聚乙烯亚胺(bPEI25)由Cy5或Cy7.5与bPEI25的DMSO混合溶液在40℃条件下反应12h制备.Cy7.5或Cy5标记的纳米粒的制备与上述方法相似.应用激光粒度测定仪测定纳米止血剂的粒径,电位并通过透射电镜(TEM)观察纳米粒的形态. 2.熊去氧胆酸与bPEI的相互作用研究 聚合物bPEI用分子操作环境软件(MOE)合成,bPEI聚合物链的重复单位设置为40,5个单位用于模拟聚合物与聚合物的相互作用.用MOE软件模拟UDCA/bPEI25纳米粒的分子间作用力.应用红外光谱仪(FT-IR)和核磁共振波谱仪(1HNMR)表征样品结构,验证熊去氧胆酸(UDCA)与bPEI间自组装作用力. 3.体外血小板聚集实验 大鼠麻醉取血后,血液储存在肝素钠管中.全血1000rpm离心10min得到富血小板血浆(PRP).剩余物3000rpm离心10min获得贫血小板血浆(PPP).PRP用PPP重悬调节血小板浓度. 100μL重建血小板与UDCA/bPEI25纳米止血剂孵育后,加入戊二醛固定1h.用相差显微镜观察血小板的聚集状态.样品固定后用不同浓度的乙醇梯度脱水,脱水后用扫描电镜(SEM)观察. 500μL的PRP加入异硫氰酸荧光素标记的抗CD61抗体(FITC-CD61)孵育40min,样品1600g离心5min得到FITC标记的血小板.在血小板中加入UDCA/Cy5-bPEI25纳米粒溶液孵育后,用戊二醛固定1h,激光共聚焦观察血小板形态. 血小板聚集仪定量测定血小板聚集.全血加入不同浓度的自组装纳米止血剂或二磷酸腺苷(ADP)后,在室温条件下磁力搅拌5min,搅拌后测量血小板的聚集曲线. 4.小鼠尾部出血实验 C57BL/6小鼠,在小鼠尾部(距离尾尖5mm处)剪断,将小鼠尾部浸润在预热(37℃)的生理盐水,bPEI25或纳米止血剂的溶液中,记录小鼠尾部的出血时间. 5.大鼠肝脏的止血实验 大鼠麻醉后沿腹中线切开暴露出大鼠肝脏,肝脏左叶用手术刀横切成两部分,肝脏损伤局部应用纳米止血剂后,观察大鼠肝脏损伤处的出血时间. 6.大鼠股动脉局部出血实验 Sprague-Dawley(SD)大鼠麻醉后,暴露出股动脉.用针刺伤股动脉血管,在股动脉损伤处滴注纳米止血剂溶液,生理盐水作为空白对照.记录股动脉出血时间. 7.尾静脉注射纳米止血剂对大鼠股动脉出血时间的影响 SD大鼠麻醉后,纳米止血剂以6mg/kg的剂量尾静脉注射到大鼠体内,生理盐水与bPEI25作为对照分别注射到大鼠体内.5min后刺伤大鼠股动脉,比较不同治疗措施对大鼠股动脉损伤部位的出血时间的影响. 8.UDCA/Cy7.5-bPEI25纳米粒的体内循环时间 UDCA/Cy7.5-bPEI25纳米溶液注射到大鼠体内后,在不同的时间点静脉取血,观察血液中的荧光强度,评价纳米粒在体内清除速度. 9.纳米止血剂在大鼠体内的安全性实验 12只雄性大鼠随机分为两组,UDCA/bPEI25尾静脉注射到大鼠体内,注射剂量为24mg/kg,生理盐水作为空白对照.2周后,取出大鼠体内主要脏器组织和血液.分析血液样品,评价其脏器指数.组织病理切片用苏木精-伊红(H&E)染色观察. 10.活性氧响应材料的制备 2g4-羟甲基苯硼酸频哪醇酯(PBAP)溶解在12mL的无水二氯甲烷中,在溶液中加入2.8gN,N-羰基二咪唑(CDI).反应30min后,再加入一定量的无水二氯甲烷,用去离子水洗涤.有机相洗涤干燥后浓缩获得CDI活化的PBAP.250mgβ环糊精(β-CD)溶解在无水二甲亚砜中,同时加入0.8mg4-二甲氨基吡啶(DMAP)和1.5gCDI活化的PBAP.样品冻干后用1HNMR表征其结构. 11.环肽配体修饰的聚合物的制备 羧基修饰的二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇(DSPE-PEG-COOH)溶于N,N-二甲基甲酰胺(DMF)后,加入N-羟基丁二酰亚胺(NHS)和N-(3-二甲氨基丙基)-N-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC?HCl)至溶液中.经反应活化后,加入过量的环肽配体(cRGDfK)到混合样品中,磁力搅拌反应24h.反应后样品透析纯化冻干后获得DSPE-PEG-cRGDfK聚合物.应用质谱、核磁表征合成聚合物的结构. 12.响应性纳米药物的制备 载体材料与RAP分别溶于甲醇或乙腈中形成有机相.卵磷脂与二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇(DSPE-PEG)溶于乙醇中,加入去离子水制备水相.水相65℃反应30min后,将有机相缓缓加入预热的水相中,反应2h除去有机相后将样品收集得到ROS响应性纳米药物(OR)和非响应性纳米药物(PR).样品经离心洗涤后冻干保存.空白纳米粒及Cy5或Cy7.5标记的纳米系统按相似的方法制备.cRGDfK功能化纳米药物(ROR)的制备与上述方法相似,其中DSPE-PEG与DSPE-PEG-cRGDfK的质量比为4∶1. 13.细胞膜囊泡与巨噬细胞膜修饰纳米药物的制备 大鼠肺泡巨噬细胞(NR8383)用TM缓冲液溶解后,匀浆.细胞匀浆液与蔗糖混合离心制备细胞膜.细胞膜经聚碳酸酯膜挤压后制备细胞膜囊泡(CMV),与ROR纳米药物混合挤压制备巨噬细胞膜修饰纳米药物(CROR). 14.纳米药物的表征 利用粒度仪测量纳米药物的粒径,表面电位.TEM观察不同纳米药物形态.CMV与CROR纳米药物的蛋白特性用聚丙烯酰氨凝胶电泳表征.同时研究空白纳米粒或纳米药物在不同溶液中的水解,释药行为. 15.纳米药物的体外生物学效应 用细胞毒性检测试剂盒(CCK-8)测定空白纳米粒与平滑肌细胞(VSMCs)孵育后的细胞活性.不同荧光标记的纳米粒与VSMCs或264.7小鼠巨噬细胞孵育后,用激光共聚焦与细胞流式仪测定细胞对纳米粒的吞噬行为.VSMCs用纳米药物预处理后加入无机磷(Ca/Pi),观察细胞的钙化程度.纳米药物加到VSMCs后,细胞用过氧化氢(H2O2)处理,观察细胞的凋亡与ROS含量. 16.纳米药物体内防治腹主动脉瘤的效果 氯化钙介导大鼠AAA模型建立后,尾静脉注射荧光标记的纳米粒,血管离体成像观察荧光的聚集及强度.为了研究纳米粒的体内疗效,注射级联多功能响应性纳米药物后,测定AAA血管的直径.血管经苏木精-伊红(H&E)、弹性纤维(VVG)、茜素红染色观察血管的弹性纤维层破坏和钙化程度.同时应用免疫组化、蛋白质免疫印迹(WB)、炎症因子测定试剂盒、二氢乙啶(DHE)染色测定血管的炎症、内皮细胞完整性、基质金属蛋白酶(MMPs)、炎症趋化因子与活性氧(ROS)的表达.响应性纳米药物的体内代谢与安全性实验通过尾静脉注射纳米药物,观察相关指标. 1.质量比为1∶1,2∶1,3∶1和4∶1的UDCA/bPEI25自组装纳米止血剂的粒径分别为171±3,221±7,195±2,191±2nm.所有自组装纳米止血剂均带正电荷.胆酸与聚乙烯亚胺聚合物间的分子间作用力包括静电作用、氢键和疏水作用. 2.UDCA/bPEI25纳米粒在体外可以促进血小板聚集及激活血小板,且与血小板激动剂ADP相比,对血小板的激活作用更加显著. 3.在不同动物模型的出血实验(小鼠尾部损伤出血,大鼠、兔子肝脏、股动脉损伤出血)中,不同质量比的UDCA/bPEI25自组装纳米止血剂应用在损伤部位.实验结果表明随着UDCA的投料比的增加,纳米粒的止血效果更好.并且纳米粒的止血效果在一定范围内随着纳米粒浓度的增加而增加.UDCA与不同结构的聚乙烯亚胺自组装形成的纳米止血剂可以有效的降低动物损伤部位的出血时间.同样,bPEI25与不同结构的胆酸类药物自组装形成纳米粒后,也具有止血效果. 4.自组装纳米止血剂UDCA/bPEI25通过尾静脉注射到大鼠体内后,极大的减少了大鼠股动脉血管损伤部位的出血时间. 5.UDCA/Cy7.5-bPEI25在大鼠体内可以被快速的清除.纳米粒尾静脉注射后主要聚集在大鼠肝、脾、肺.并且纳米止血剂可以靶向到股动脉损伤的部位,在股动脉出血局部大量聚集.纳米粒尾静脉注射后,大鼠行为、体重变化正常,病理切片无明显炎症浸润,证实纳米止血剂的体内安全性. 6.核磁图谱证实每个β-CD分子约与6个PBAP连接形成ROS响应性材料OxbCD.PR纳米药物与OR纳米药物的平均粒径分别为197±3和167±4nm.PR,OR,ROR,CROR纳米药物表面均带有负电荷. 7.级联多功能响应性纳米药物OR、ROR、CROR在含有1.0mMH2O2的条件下可以促进RAP的释放,与OxbCD,RO,CRO空纳米粒的水解实验的结果相一致. 8.不同纳米粒与大鼠VSMCs或RAW264.7小鼠巨噬细胞孵育后,可观察到细胞对纳米粒的吞噬现象,孵育时间越长,吞噬效果更明显.体外细胞实验中,应用CROR,ROR,OR纳米药物预处理,可以减少VSMCs钙沉积,凋亡以及抑制细胞ROS的产生.并且CROR纳米药物的治疗效果最显著,其次是ROR纳米药物. 9.尾静脉注射荧光标记的响应性纳米粒后,可在AAA血管损伤局部观察大量荧光信号,说明级联多功能响应性纳米药物具有靶向作用.并且,CROR纳米药物的靶向性最强,其次是ROR纳米药物,OR纳米药物的靶向性相对较差. 10.RAP载药纳米粒体内注射可以减轻血管钙化程度,降低基质金属蛋酶与炎症因子的表达,有效的抑制氯化钙介导的大鼠AAA的的发生发展.同时,巨噬细胞膜修饰功能化响应性纳米药物(CROR)的靶向、治疗效果最佳.纳米药物在体内的循环时间短,在大鼠体内的安全性较高. 1.胆酸与聚乙烯亚胺通过多重非共价键(静电作用、氢键和疏水作用力)自组装形成纳米止血剂. 2.自组装纳米止血剂可以激活血小板从而促进血小板的聚集.在不同的动物体内出血模型中,PEIs可以降低实验动物的出血时间.PEIs与胆酸自组装形成纳米粒后,止血效果显著提高.这个现象可能是由于PEIs与胆酸自组装成纳米粒后,表面电位增大的原因造成的. 3.由于AAA的病理特征表现为局部ROS水平升高,因此我们设计了ROS响应性纳米药物(OR)靶向到AAA血管局部,达到预防治疗AAA的作用.为了进一步提高靶向效率,我们利用cRGDfK修饰纳米药物形成ROR主动靶向到AAA,增强了对AAA的防治作用.最后利用仿生学技术,将巨噬细胞膜包裹在ROR纳米药物表面形成CROR纳米药物,通过同源靶向,进一步提高了纳米药物的体内疗效. 4.通过体外生物学研究及体内疗效评价,级联多功能响应性纳米药物可以抑制细胞钙化、凋亡;尾静脉注射可以靶向到AAA血管损伤部位,在损伤局部释放药物从而达到高效治疗AAA的目的. 总之,PEIs与胆酸自组装形成的正电荷纳米粒,可以作为高效、价格低廉、安全的局部或注射使用的纳米止血剂.在医院或战场中可以有效的抑制不可控的止血,挽救生命.根据AAA病理特征设计的级联多功能纳米载药系统(OR,ROR,CROR)可以有效靶向到AAA损伤部位释放药物达到高效治疗AAA的目的.