稻瘟病菌MoRgs3互作蛋白的筛选与功能研究

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水稻是我国最主要的粮食之一,在我国的栽种面积可达3千万公顷左右,总产量可高达2亿吨。由稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae)引起的稻瘟病是水稻上的三大病害之一,可能造成超过百分之五十的减产。通常发生于高温高湿天气,全生育期皆可发生,根据发病部位可分为苗瘟、叶瘟和节瘟等。目前防治稻瘟病主要通过选种高抗品种和化学防治等手段,但抗病品种的抗病性易丧失以及化学防治造成的污染都是不可避免的难题。因此,从分子水平上研究稻瘟病菌的致病机制能够为我们防控稻瘟病提供有效手段。真菌中的G蛋白信号传导通路通常由G蛋白、G蛋白偶联受体以及下游的各种效应蛋白组成。外部的刺激信号激活G蛋白信号传导途径中的信号分子,引起细胞内部的表达,紧接产生相应的行为。研究发现,G蛋白信号途径参与真菌的菌丝生长与分化、次级代谢产物的合成以及致病性等相关过程。RGS是一种由具有多种功能、分子大小相同的蛋白组成的蛋白质大家族,目前所知的大多数RGS蛋白都包含一段120-130个氨基酸组成的高度保守序列,称为RGS domain;各种RGS蛋白之间在分子大小、结构、功能和氨基酸的同源性方面也存在着巨大的差异。在G蛋白信号传导过程当中,RGS结构域与Gα亚基相结合,Gα亚基的GTPase活性被激活,从而负调控G蛋白的信号传导。本研究通过酵母双杂交和免疫共沉淀的方法筛选到MoRgs3的10个互作蛋白,获得了它们的基因敲除突变体,研究了其中MoYnk1和MoRip1两个蛋白的基础表型和简单功能。在酵母研究中发现,Ynk1可以修复DNA损伤,Ynk1的缺失将导致修复UV和依托泊苷引起的核DNA损伤延迟3-6小时,这表明了Ynk1的一种抗突变功能。Ynk1包含一个核苷二磷酸激酶(NDPK),该酶除了催化腺苷三磷酸(ATP)和核苷二磷酸(NDP)之间高能磷酸基团的转移外,还具有NDP激酶活性和蛋白磷酸转移酶活性,并参与转录调控和信号转导。MoYnk1的缺失对菌丝的营养生长和产孢量以及孢子萌发没有影响,但是分生孢子存在部分两个隔膜的畸形,附着胞形成从4h开始出现部分芽管延长,孢子的膨压相比于野生型Guy11显著降低,糖原转移和脂质降解延迟,ΔMoynk1胞内cAMP浓度也显著高于野生型Guy11。亚细胞定位观察发现MoYnk1主要定位于细胞质内。以上表明MoYnk1主要影响分生孢子的形成、孢子的膨压和糖原脂质的转移降解从而降低致病力并且负调控cAMP信号途径。MoRip1是含有2个跨膜结构域的假定蛋白,MoRip1的缺失对菌丝的营养生长没有影响,产孢量相比于野生型Guy11显著减少且在2-4h时分生孢子萌发和附着胞形成显著延迟,膨压降低明显,糖原转移和脂质降解延迟,通过胞内cAMP含量测定发现与野生型Guy11没有差异。表明MoRip1主要参与分生孢子的产生、萌发及附着胞形成过程降低致病力。
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