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第一部分:孕期缺氧对胎鼠骨发育的影响及其机制1.1目的:研究孕期缺氧对胎鼠骨发育的影响及其机制1.2方法:孕鼠随机分为对照组和缺氧组,每组各20只。从妊娠第4天到第20天将孕鼠放入缺氧箱(氧浓度为10.5%),定义为缺氧组;将孕鼠放入体积相同的常氧箱(氧浓度为21%),定义为对照组。在妊娠第20天时,麻醉后,剖开孕鼠腹腔,取出胎鼠,立即测量胎鼠体长和体重,并根据标准计算胎儿宫内生长迟缓率。解剖显微镜下分离胎鼠左股骨(每窝),将部分股骨固定于10%多聚甲醛溶液24小时,然后分别行脱水、石蜡包埋。将股骨切片,苏木精-伊红染色(HE)用以测股骨长度(FL)和钙化区长度(CL)。按照制造商的指示行番红-O-快染以测定蛋白多糖含量。免疫组织化学是用DAB染色试剂盒测定股骨生长板胰岛素样生长因子1(IGF1)﹑胰岛素样生长因子2(IGF2)﹑胰岛素样生长因子1受体(IGF1R)、胰岛素样生长因子1受体(IGF1R)、胰岛素样生长因子受体(IGF1R)、胰岛素受体底物(IRS)-1和IRS2,和丝氨酸苏氨酸蛋白激酶(Akt)、蛋白聚糖Aggrecan,Ⅱ型胶原蛋白a1(Col2a1),和Ⅰ型胶原蛋白a1(Col1a1)的表达量。剩余股骨标本在解剖显微镜下分离出生长板用于后续实验。q RT-PCR和Western blot法检测软骨生长板上相关基因和蛋白的表达水平。我们在体外分离、培养胎儿生长板软骨细胞,将其在正常或缺氧环境(1%)下培养48小时,然后q RT-PCR法测试软骨细胞中IGF1信号通路和ECM相关基因的表达水平。1.3结果:与对照组相比,孕期缺氧胎鼠体重、体长都减少,有宫内生长受限,且宫内生长受限率增加,股骨长减少,CL/FL减少(P<0.05);胎鼠股骨近端番红-O-快染色:孕期缺氧组胎鼠股骨生长板MOD值减低(P<0.05);缺氧组胎鼠股骨生长板上IGF通路中胰岛素样生长因子1﹑胰岛素样生长因子1受体基因表达降低,胰岛素受体底物1﹑丝氨酸苏氨酸蛋白激酶基因表达降低,进而使得软骨基质特异性基因Aggrecan﹑Col1a1﹑Col2a1表达降低(P<0.05);免疫组化及Western Blot示:IGF-1信号通路中胰岛素样生长因子1﹑胰岛素样生长因子1受体蛋白表达降低,IAKT1/2,IRS1蛋白表达降低(P<0.05);软骨基质特异性蛋白Aggrecan﹑Col1a1﹑Col2a1蛋白表达降低(P<0.05)。体外细胞培养:缺氧48H使得软骨细胞m RNA水平,IGF通路中在IGF1﹑IGF1R降低,ISR1﹑AKT1﹑AKT2基因表达降低,软骨基质特异性蛋白蛋白聚糖,Ⅱ型胶原蛋白a1,和Ⅰ型胶原蛋白a1表达降低。结论:1)孕期缺氧可导致胎鼠宫内发育受限并阻碍胎鼠骨骼发育2)其机制与IGF通路有关:宫内缺氧使得IGF通路中IGF1﹑IGF1R降低,ISR1﹑AKT1﹑AKT2表达降低,进而使得软骨基质特异性蛋白Aggrecan﹑Col1a1﹑Col2a1表达降低。第二部分:孕期缺氧对子代大鼠骨质疏松症的影响及其机制2.1目的:研究孕期缺氧对卵巢切除子代大鼠骨质疏松的影响及其机制。2.2方法:将孕期缺氧的子代定义为缺氧组;孕期常氧的子代定义为对照组。将缺氧组和对照组雌性子代常规喂养至9月龄,在戊巴比妥麻醉下(100 mg/kg)采用微创外科技术进行双侧卵巢切除术(OVX),术后1个月处死大鼠。使用显微CT对左股骨进行骨微观结构观察分析以测定骨质疏松性的变化。剩余股骨标本用于后续实验。用q RT-PCR方法检测股骨骨质中相关基因的表达水平2.3结果:与对照组去卵巢子代大鼠相比,孕期缺氧组去卵巢子代大鼠中,股骨骨密度减少(P<0.05);骨小梁厚度(Trabecular thickness,Tb.Th)变小、骨小梁数目(Trabecular number,Tb.N)减少(P<0.05)、骨小梁间隙(Trabecular spacing,Tb.Sp)无明显变化(P>0.05);TBPf:骨小梁模式因子Trabecular Bone Pattern factor TBPf增加(P<0.05)SMI:结构模型指数(Structure Model Index SMI)增加(P<0.05);DA:各向异性的程度Degree of Anisotropy,DA增加(P<0.05)。RT-PCR示:孕期缺氧组卵巢切除子代大鼠股骨骨质的IGF通路中IGF1﹑IGF1R基因表达降低,软骨基质Col1a1﹑Col2a1特异性基因表达降低(P<0.05)。结论:对照组相比,孕期缺氧去卵巢子代大鼠股骨中表现的骨质疏松症更严重,其股骨组织中Col1a1﹑Col2a1表达水平降低,IGF信号通路表达下调。结果表明:孕期缺氧不仅延缓胎儿骨骼生长,也可能通过下调IGF1信号传导和抑制ECM合成从而加重孕期缺氧子代卵巢切除诱导的骨质疏松症,为研究孕期缺氧对胎儿和子代骨发育和代谢的影响提供重要认识。