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目的:骨骼肌是人体最大的摄取餐后葡萄糖的组织,胰岛素促进骨骼肌摄取葡萄糖障碍在2型糖尿病发生发展过程中起关键作用,非胰岛素依赖方式促进骨骼肌摄取葡萄糖可有效预防和治疗2型糖尿病。运动或AMPK激活剂AICAR均通过AMPK促进骨骼肌摄取葡萄糖,此外,Rac1也参与运动调节骨骼肌葡萄糖摄取的作用。本课题组前期工作发现AICAR激活C2C12小鼠骨骼肌细胞Rac1,Rac1抑制剂Rac1 inhibitor II显著抑制AICAR促进的GLUT4转位,提示Rac1可能介导AICAR的作用。Rac是小G蛋白,其活化由Rac鸟苷交换因子(Rac-GEFs)调节,Tiam1和VAV2均可作为Rac-GEF激活Rac1,本研究探讨Tiam1和VAV2是否介导AICAR激活Rac1,促进骨骼肌细胞摄取葡萄糖的作用。内容:第一部分,应用AICAR孵育C2C12肌管细胞,Western blot检测Rac-GEF Tiam1和VAV2的蛋白及磷酸化水平。第二部分,应用药物抑制剂、腺病毒以及siRNA,上调或者下调AMPK或Tiam1,探讨AMPK与Tiam1的上下游关系:1.感染激活型AMPK腺病毒(Ad-AMPK-CA),检测C2C12细胞中Tiam1蛋白水平;2.分别应用AMPK抑制剂Compound C或siAMPK抑制AMPK,检测C2C12肌管中Tiam1蛋白水平;3.应用siTiam1,检测C2C12肌管中AMPK磷酸化水平。第三部分,应用siTiam1,检测Tiam1在AICAR促进C2C12肌管摄取葡萄糖机制中的作用。方法:培养C2C12骨骼肌成肌细胞分化成肌管,用AICAR孵育,免疫印迹检测Tiam1及VAV2的蛋白表达,免疫共沉淀检测VAV2蛋白酪氨酸磷酸化水平。应用抑制剂、腺病毒和siRNA,上调或者下调AMPK或Tiam1的表达或活性,检测AICAR调节的C2C12肌管葡萄糖摄取。结果:第一部分结果显示:AICAR孵育3小时,上调C2C12肌管Tiam1的蛋白,而不影响VAV2的蛋白及酪氨酸磷酸化,说明AICAR作用下,Tiam1可能参与AMPK激活Rac1的作用。第二部分结果显示:感染激活型AMPK腺病毒上调骨骼肌细胞Tiam1蛋白水平,Compound C和siAMPK抑制此作用;siTiam1不影响AICAR磷酸化AMPK的作用,说明AMPK位于Tiam1上游,Tiam1受AMPK活性的调节。第三部分结果显示:siTiam1抑制AICAR促进的C2C12肌管葡萄糖摄取。结论:AMPK-Tiam1-Rac1信号通路介导AICAR促进骨骼肌细胞摄取葡萄糖的作用。