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丙型病毒性肝炎是一种严重危害人类健康的疾病。丙型肝炎病毒（hepatitis Cvirus，HCV）急性感染后50％-80％转变为慢性感染，其中的10％-20％发展成肝硬化，且与肝细胞癌的发生密切相关。目前尚无有效疗法，加强对HCV防治研究至关重要。丙型病毒性肝炎治疗的主要策略之一是针对病毒基因组或其所表达的关键蛋白进行抗病毒治疗，其中内部核糖体进入位点（internal ribosome entry site，IRES）是目前抗病毒治疗研究的主要靶位之一。HCV IRES是一个双功能分子，一方面介导并控制着整个HCV基因组的翻译过程；另一方面HCV IRES抑制PKR的活性从而降低干扰素抗病毒的效果，且IRES又是HCV基因组中最保守的序列，因此，研究靶向HCV IRES的拮抗剂具有十分重要的意义。多年来针对HCV IRES抑制剂的研究取得可喜的进展，寡核苷酸适配子（Aptamers）和干涉性小dsRNA（siRNA）等药物在体外或细胞体系均显示出良好的抗病毒作用。但由于缺乏理想的HCV感染小动物实验模型，这些药物在体内抗HCV的作用效果以及对其毒性、安全性等难以作出评估，极大地延缓了这些药物临床应用。本课题基于成年小鼠，联合应用水动力转染技术与噬菌体整合酶系统，建立HCV IRES小鼠体内长期表达模型，作为经典转基因技术的补充或替代，用于评估HCV IRES抑制剂—shRNA、寡核苷酸适配子（Aptamers）等在体内抗HCV的作用效果。具体研究内容及结果如下：1．构建了可促进外源基因在小鼠体内长期高水平表达的质粒pCI-attB-AAA-HCV IRES-Fluc-neo。该载体含有肝脏特异性调控序列组合AerApoEAAT（AAA）与噬菌体整合酶φc31-int识别位点attB，报告基因Fluc的表达活性代表了HCV IRES的功能。将pCI-attB-AAA-HCVIRES-Fluc-neo与对照载体pCI-attB-CMV-HCVIRES-Fluc-neo分别转染至小鼠肝脏，实验证实，肝脏特异性启动子AAA启动效率虽略低于CMV启动子，但它使Fluc表达持续时间长于CMV启动子，达20d左右。此外，水动力转染技术对小鼠肝脏无明显病理损伤，不同种属小鼠间Fluc的表达也无显著影响。2．利用φC31-int介导位点特异性整合反应的特点，建立HCV IRES介导Fluc在小鼠内长期表达模型。通过水动力转染将表达载体pCI-attB-AAA-HCV IRES-Fluc-neo与编码野生型φC31-int的表达载体pCMVint共转染至小鼠体内。实验证实，在φC31-int作用下，Fluc表达框架整合到小鼠肝脏染色体上，Fluc在小鼠肝脏获得长期表达，在共转染后30d左右其表达趋于稳定，可长达300d。对获得稳定表达Fluc的小鼠行2／3肝脏切除术，2周后小鼠Fluc的表达随肝脏组织再生而逐步恢复，表明Fluc表达框架整合至小鼠染色体上。nest-PCR结果进一步证实，Fluc表达框架在小鼠第2号染色体的mpsL1位点处发生位点特异性整合，生成两个杂合位点attR和attL，整合铰链区（core area）为TTG，且有3-6个碱基的丢失。3．在此动物模型基础上，对靶向HCV IRES不同靶位的shRNA和适配子Apamer进行了体内作用效果评价。本实验分别在pSilencer TM2.1-U6 neo和pAV7SL载体基础上，构建了发夹型siRNA——shIRES184、shIRES256表达质粒和适配子A-256表达质粒（它们分别靶向HCVIRES的Ⅲb、Ⅲd茎环）。结果显示，在HepG2和HepG2.9706细胞与小鼠模型评价体系中，它们均有抑制HCV IRES的功能，单个或几个碱基的改变就可使其失效。同时发现，shRNA184和A-256联合用药有协同作用，而shRNA256和A-256联合用药则有拮抗作用。将表达shRNA和A-256的质粒转入细胞和小鼠体内后，分别于48h、3d达到最大抑制效率。间隔一段时间重复转染可获得相似的抑制作用动态曲线，表明所建立的小鼠模型有较好的稳定性。总之，本研究将水动力转染技术及噬菌体整合酶系统联合应用，建立了HCV IRES小鼠体内长期表达模型。利用该模型对抗HCV药物作用效果进行了评价，为今后进行抗HCV的基因治疗奠定一定的基础。