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食品致病菌污染是导致食品安全的主要因素之一。食品致病菌的快速检测方法中,致病菌DNA的获取一直是耗时、繁琐的过程,严重减慢了检测速度。其中试剂盒方法具有纯度高、结果稳定、高效的特点,是目前应用最为广泛的一种DNA快速提取方法。但其价格昂贵,操作繁琐,耗时长。本研究以试剂盒方法为参照,建立了两种快速、有效的DNA提取方法,分别为改良水煮方法和改良树脂方法。主要内容如下: (1)以革兰氏阳性菌(金黄色葡萄球菌、单核增生李斯特菌、枯草芽孢杆菌、鼠李糖杆菌)和革兰氏阴性菌(乙型副伤寒沙门氏菌、志贺氏菌、大肠杆菌和副溶血性弧菌)为实验菌株,比较了试剂盒法、水煮法、树脂法、酶法及反复冻融法对菌株DNA提取的效果。结果表明改良后反复冻融法所提取的DNA浓度低、纯度低,操作时间长达数小时,而改良后的酶法提取的DNA含有影响PCR反应的抑制剂。 (2)进一步通过比较提取温度、时间及不同实验菌株,建立了水煮提取法及阶段控温快速提取法。水煮法是70℃水浴15min,提取的DNA满足PCR检测要求,时间需15min,纯度OD260/OD280达1.5-1.8,浓度较现有煮沸方法高20%,且有效避免DNA的降解。阶段控温快速是110℃油浴20s后70℃水浴10min,离心取上清即得DNA。提取时间不到11min,但提取浓度较水煮方法提高35%。 (3)在改良水煮方法基础上,通过改良现有树脂chelex-100方法提取DNA,建立了一种改良树脂chelex-100方法,即加入5%的chelex-100后于110℃油浴20s再70℃水浴10min提取致病菌DNA,提取的DNA满足PCR扩增要求。该方法较现有树脂方法时间缩短了2/3,只需不到11min,浓度和纯度相对比改良水煮方法高,其中纯度即OD260/OD280达1.8左右。 (4)两种改良方法与试剂盒方法相比,时间缩短至1/9,只需不到11min,操作步骤仅2步,而试剂盒方法长达1.5h,操作步骤8步。在-20℃的相同保存条件下,试剂盒法可保存7个月或以上,改良水煮方法只能保存1个月左右,改良树脂方法可保存3个月左右。两种改良方法提取的DNA与试剂盒方法效果一致,提取的DNA质量都符合后续检测反应如普通PCR,荧光PCR以及LAMP扩增的要求。 (5)以不同浓度1-10CFU/mL金黄色葡萄球菌和乙型副伤寒沙门氏菌人工污染灭菌奶、酱油和猪肉制品,再用改良水煮、改良树脂和试剂盒方法提取被污染过的食品中的致病菌DNA。结果发现,所提取的DNA能满足普通PCR、荧光PCR和LAMP等分子生物学的实验需求。且所建立的改良水煮和树脂方法结合LAMP方法以及荧光PCR方法6h即可检测食品样品中起始1-10CFU/mL的致病菌。 综上所述,本研究所建立的改良水煮和改良树脂方法具有效率高、耗时短、经济等优点,且所提取的DNA能满足常规PCR、荧光PCR和LAMP检测方法的质量要求,并能成功应用于食品中的检测。