苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis,简称Bt)属于蜡样芽胞杆菌属(B.cereus group),是一种可以产生芽胞与伴胞晶体的革兰氏阳性细菌。晶体和芽胞的混合物可以作为制剂在田间应用,但在应用过程中释放的晶体在自然条件下不稳定易失活,芽胞的大量释放可能存在一定的生态风险。前期研究发现,spoIIID基因的缺失使细胞不产生芽胞,但是关于spoIIID基因对母细胞裂解与晶体产量的影响还未有报道。本研究主要展开了spoIIID突变体中Cry蛋白表达和细胞裂解的研究工作:1.利用β-半乳糖苷酶活性检测启动子活性,发现在Bt中SpoIIID,σ~E和σ~K之间的转录调控关系与枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis,简称Bs)中相同,SpoIIID正调控sigK,σ~K反过来抑制sigE基因的转录。光学显微镜观察发现spoIIID基因的缺失影响母细胞的裂解并受到不同营养条件的影响,在SSM与LB培养基中母细胞不裂解,而在1/2 LB培养基中裂解。在SSM与1/2 LB培养基中进一步分析了cwlC(母细胞裂解的关键基因)的转录活性,在两种培养基中cwlC在野生株中的转录活性均远远高于在突变株中,且在1/2 LB培养基中cwlC的转录活性略高于在SSM中。因此在spoIIID突变的基础上,通过同源重组的方法对cwlC基因进行了敲除,获得的双突变株HD(ΔspoIIID)(ΔcwlC)在任何培养基中均不裂解也不产生芽胞。2.在HD73菌株中spoIIID基因的缺失降低了Cry1Ac杀虫晶体蛋白(其启动子有依赖于σ~K的活性)的产量,将只依赖于σ~E的orf1cry8E与5014两个强启动子导入spoIIID突变株,两个启动子在spoIIID突变株中的转录活性与HD73野生株相比基本相当,说明spoIIID突变体中两个启动子均具有很高活性。SDS-PAGE与对小菜蛾的杀虫活性结果显示,在HD~-(ΔspoIIID)中orf1cry8E和5014启动子可以指导cry1Ac产生与HD73野生株等量的晶体蛋白,且对小菜蛾的杀虫活性与野生株相当。3.通过基因芯片数据分析了spoIIID突变株中转录活性高的基因,构建了相应启动子与lacZ的融合表达载体,进行了β-半乳糖苷酶活性检测,结果表明未发现比orf1cry8E和5014启动子具有更高活性的启动子,有待进一步筛选。通过生物信息学分析了Bt中可能受到SpoIIID调控的基因,并完成了SpoIIID蛋白的表达纯化,为确定SpoIIID的调节子奠定了基础。本研究在spoIIID缺失的遗传背景下分析了启动子的活性和对母细胞裂解的影响,筛选到两个高活性启动子可用于此遗传背景下的表达元件;同时获得的双突变株具有不产生芽胞和母细胞不裂解的特性,这种构建方法为Bt工程菌株改良提供了一种新策略。