【摘 要】
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目的:根据文献报道,鼻疽诺卡菌是诺卡菌种中最常分离到的致病菌种之一,且在人群中的感染率呈上升趋势,目前对鼻疽诺卡菌致病机制的研究较少。本研究对鼻疽诺卡菌NFA47650蛋白首次进行研究,以该蛋白为实验对象,构建鼻疽诺卡菌NFA47650蛋白原核表达载体,诱导表达及纯化NFA47650蛋白,进行免疫原性研究,为后续诺卡菌血清学诊断以及毒力相关研究提供一定的理论基础;研究NFA47650蛋白激活免疫应
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目的:根据文献报道,鼻疽诺卡菌是诺卡菌种中最常分离到的致病菌种之一,且在人群中的感染率呈上升趋势,目前对鼻疽诺卡菌致病机制的研究较少。本研究对鼻疽诺卡菌NFA47650蛋白首次进行研究,以该蛋白为实验对象,构建鼻疽诺卡菌NFA47650蛋白原核表达载体,诱导表达及纯化NFA47650蛋白,进行免疫原性研究,为后续诺卡菌血清学诊断以及毒力相关研究提供一定的理论基础;研究NFA47650蛋白激活免疫应答和固有免疫信号通路的能力,为后续探究诺卡菌致病机制提供理论依据。方法:根据鼻疽诺卡菌nfa-47650基因序列设计并合成引物,通过PCR扩增基因片段构建p ET30a（+）表达载体,通过BL21大肠杆菌表达,通过变性、溶解、纯化、复性纯化包涵体蛋白,BCA法测定蛋白浓度。制备NFA47650蛋白抗血清以及诺卡菌抗菌血清,通过Western Blot对NFA47650蛋白进行亚细胞定位和免疫原性研究;采用ELISA法测定NFA47650蛋白刺激RAW264.7细胞后不同时间段培养上清中的促炎因子（IL-6）后和抗炎因子（IL-10）的浓度;通过Western Blot分析比较NFA47650蛋白在RAW264.7细胞中激活ERK、JNK、p38、p65及AKT磷酸化水平,研究其在固有免疫调控中的作用。结果:成功构建鼻疽诺卡菌NFA47650蛋白的原核重组表达载体,该蛋白在BL21大肠杆菌中以包涵体的形式高效表达。纯化透析后获得较高浓度的蛋白,浓度为760μg/m L。Western Blot结果显示,NFA47650蛋白主要存在于菌体培养上清中,能够被鼻疽诺卡菌抗小鼠和兔血清特异性识别。另外,该蛋白与巴西诺卡菌和盖尔森基兴诺卡菌抗小鼠血清均可发生血清交叉反应。ELISA结果表明,NFA47650蛋白能够刺激RAW264.7细胞分泌炎性细胞因子IL-6和IL-10,并且IL-6和IL-10的浓度随着刺激时间的增加呈现上升趋势,在刺激24小时后IL-6和IL-10浓度呈现出较高水平。Western Blot结果显示NFA47650蛋白可激活NF-κB信号通路和MAPK信号通路。值得注意的是,JNK和p38的磷酸化水平随着时间的延长而增强,并且持续时间较长,至少能维持2小时,但p38磷酸化比JNK快,在15min时就能发生磷酸化。AKT的磷酸化水平随着时间的增加逐渐抑制,在1小时后几乎不能使AKT发生磷酸化,在15min磷酸化水平较为明显。结论:此次研究发现,鼻疽诺卡菌NFA47650蛋白是一种分泌性蛋白,可以与不同种的诺卡菌抗血清发生免疫反应。NFA47650蛋白能够刺激机体产生特异性抗体,参与体液免疫,引起免疫应答,是一种重要的免疫显性蛋白。NFA47650蛋白能够刺激RAW264.7细胞分泌促炎细胞因子IL-6和抑炎细胞因子IL-10,尤其是以IL-6浓度较高,并能使NF-κB和MAPK信号通路发生磷酸化而激活固有免疫信号通路。该蛋白在诺卡菌致病过程中,可调控固有免疫信号通路和相应的细胞因子表达,为鼻疽诺卡菌与宿主细胞相互作用机制提供了可参考的理论价值。
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