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热泉生境微生物具有特殊的生理机能和代谢机制,被认为是寻找高温酶资源的宝库。本研究通过纯培养技术与宏基因组技术相结合的方式,系统地开展了瑞滇热泉中嗜热原核微生物的多样性研究,同时筛选具有纤维素酶和木聚糖酶活性的菌株,并通过3种数据库(COG、KEEG和CAZy)对获得的微生物宏基因组中的纤维素酶和木聚糖酶基因进行标记与分析,构建金泽热泉微生物宏基因组Fosmid文库,进而筛选纤维素酶和木聚糖酶基因资源,以期通过异源表达的方式获得高温酶。本研究旨在通过获得的高温酶菌株及高温酶基因为水产饲料加工与生产提供丰富、高效的酶制剂。本研究以瑞滇3个热泉的沉积物、泉水和富集物3类样品为研究对象开展相关研究,取得的研究结果主要包括:(1)通过设计7种分离培养基、采用3个温度梯度对19个热泉样品进行嗜热原核微生物的分离,共分离得到1042株嗜热菌株,分属于异常球菌-栖热菌门(Deinococus-Thermus,39.8%)、厚壁菌门(Firmicutes,28.7%)、变形菌门(Proteobacteria,22.0%)、放线菌门(Actinobacteria,6.8%)、绿弯菌门(Chloroflexi,2.3%)、拟杆菌门(Bacteroidetes,0.3%)和Rhodothermaeota 门(0.1%)。这 7 个门包括 12个纲,24 个目,30 个科,46个属,存在 41 个潜在新分类单元。Thermus(27.7%)、Anoxybacillus(13.8%)、Meiothemus(11.7%)、Bacillus(7.3%)和 Caldimonas(7.2%)是纯培养获得的丰度较高的优势属。宏基因组测序结果显示,瑞滇热泉嗜热微生物中占优势的门主要为绿弯菌门(13.5%)、酸杆菌门(Acidobacteria,12.3%)、变形菌门(10.7%)、装甲菌门(Armatimonadetes,7.9%)、厚壁菌门(6.4%)和深古菌门(Bathyarchaeota,5.1%)。属水平占优势的主要类群为装甲菌门的未分类属(unclassified Armatimonadetes,7.5%)和深古菌门的未分类属(unclassified Bathyarchaeota,5.1%)。其中Thermus属(宏基因组数据中丰度为2.4%)在两种研究方法中均呈现较高的丰度,表明瑞滇热泉中的优势类群Thermus属易通过实验室纯培养的方法被分离。样品、分离温度、分离培养基等因素对纯培养获得的菌株的多样性均有显著影响。(2)通过分子分类学、形态学、生理生化特征及酶学性质、化学组成等多相分类鉴定实验,确定了候选新种CFH 72773T和候选新属CFH 75059T的分类地位,分别命名为Thermus thermoamylovorans sp.nov.和Crenbacterium sediminis gen.nov.sp.nov.。(3)采用刚果红染色透明圈法对分离得到的菌株进行纤维素酶、木聚糖酶活性菌株筛选,并通过宏基因组技术对纤维素酶和木聚糖酶基因资源进行挖掘。研究结果显示,具有纤维素酶活性的菌株(共46株)主要分布于Thermus(39.1%)、Meiothermus(23.9%)、Caldimonas(13.0%)、Bacillus(10.9%)和(6.5%)属,具有木聚糖酶活性的菌株(共 91 株)主要分布于(27.5%)、Anoxybacillus(19.8%)、Meiothermus(17.6%)、Caldimonas(9.9%)和Bacillus(8.8%)属,活性菌株筛选阳性率分别为4.6%和8.7%,同时也表明Thermus属是我们寻找纤维素酶和木聚糖酶资源的重要来源。对嗜热细菌产酶菌株的分析表明,通过富集可以增加特定功能菌株的数量。洁明里、金泽样点宏基因组数据的功能注释分析结果显示,在COG数据库、KEGG数据库及CAZy数据库中,均检测到高丰度的基因,这些基因参与纤维素降解、木聚糖降解相关的碳水化合物和氨基酸代谢途径,预示着热泉样点蕴含着丰富的高温纤维素酶和木聚糖酶基因资源,其中金泽热泉的沉积物样品潜力最高。(4)选择微生物多样性与潜在酶资源丰富的金泽热泉生境,进行宏基因组Fosmid文库的构建,共获得4100个克隆,插入片段平均为36 Kb-50 Kb。基于功能筛选的方法,在生长培养基中添加羧甲基纤维素钠与木聚糖为唯一底物,使用刚果红染色透明圈法,获得16个具有纤维素酶活性的阳性克隆和12个具有木聚糖酶活性的阳性克隆。本研究系统探讨了瑞滇热泉微生物多样性,并对其高温纤维素酶和木聚糖酶资源进行探索和挖掘,获得了丰富的产酶菌株及产酶基因,为水产饲料工业提供了丰富的候选高温酶资源。