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碘乙酰胺(IA)诱导小鼠成纤维细胞水通道蛋白1(AQP1)的表达前言AQPs是最近发现的水通道家族。其中水通道蛋白AQP1是一种最先从红细胞分离出来的28kDa蛋白,它在肾脏、肺、脑,和眼均有表达,其调节机制是复杂的。体外培养小鼠成纤维细胞自然表达AQP1,故本文以小鼠成纤维细胞为研究对象,通过碘乙酰胺模拟低氧,探讨其在等渗和高渗不同状态下AQP1表达的变化。实验材料和方法一、材料1.小鼠成纤维细胞株(BALB/c 3T3)2.碘乙酰胺(IA)3.AQP1抗体4.抗兔IgG5.肌动蛋白6.胎牛血清7.MEM培养基8.山梨醇二、方法1.细胞培养和收集。小鼠成纤维细胞用含有10%FBS的培养液,放于37℃,5%CO2的孵箱中培养。另向培养液中加入山梨醇配成0.1M和0.4M的高渗培养液。实验时,细胞分别用等渗和高渗培养液孵育,并向其中加入碘乙酰胺(30umol/L),分别于0h,4h及6h收集细胞并冻结。用冰-细胞裂解液重悬浮细胞沉淀,形成一个冻融循环。细胞上清以BSA为标准,用BCA试剂盒测定蛋白浓度。2.SDS/PAGE and Western blotting。细胞溶解产物进行SDS/PAGE凝胶电泳,并且将免疫印记蛋白转印到膜上。用化学发光和放射自显影术增强免疫印记使之可见。用凝胶图象分析系统测定相对密度。3.统计学分析。测定每组通过放射自显影术得到的蛋白免疫印记结果的密度,用均值±标准差表示。对不同干涉用非配对t-检验进行统计学分析。实验结果1.细胞形态学变化正常时,细胞主要呈梭形,多角状,分裂相细胞呈类圆形,单层贴壁生长。在给予IA 4小时细胞形态变圆,体积变大;6小时细胞核增大,细胞溶解坏死。2.Western-blot免疫印记检测结果通过免疫印记定量测定,细胞等渗培养滴加IA(30umol/L)4小时,AQP1表达增加24.4%(n=6,P>0.05)。6小时AQP1表达增加193.8%(n=6,P<0.05)。细胞0.1M高渗培养滴加IA(30umol/L)4小时AQP1表达增加84.7%(n=2,P>0.05),6小时AQP1表达增加63.8%(n=2,P>0.05)。细胞0.4M高渗培养后AQP1处于高表达,滴加IA 4小时AQP1表达略有降低,为8.9%,6小时AQP1表达增加26.2%。比较高渗培养和等渗培养,高渗培养滴加IA后AQP1表达峰值前提。讨论研究表明,在有水通道蛋白表达的上皮细胞和内皮细胞,其水渗透性也高;在接近出生时肺水通道蛋白的表达是增加的;AQP1敲除小鼠肺泡-毛细血管间水的渗透性水通透性较野生型降低;肾脏、体外培养的小鼠成纤维细胞和在体小鼠高渗均诱导AQP1的表达。我们的研究显示由碘乙酰胺模拟缺氧,在等渗和高渗状态下均可诱导小鼠成纤维细胞APQ1的大量表达。我们推测缺氧条件下AQP1参与细胞水的转运。结论碘乙酰胺(IA)可诱导小鼠成纤维细胞水通道蛋白1(AQP1)的大量表达,提示缺氧条件下AQP1参与细胞水的转运。