目的：本实验以慢性粒细胞白血病细胞系的急变株K562细胞为研究对象，研究反应停(thalidomide,Thd)诱导K562细胞凋亡及其抑制K562细胞VEGF表达的作用，为将反应停应用于临床治疗白血病提供实验基础和理论依据。 方法： (1)K562细胞按常舰悬浮培养于含10％小牛血清的RPMI1640培养液中，以初始浓度1×106/mL接种于25mL培养瓶中，置于37℃，含5％CO2培养箱中孵育。每周传代2～3次，取对数生长期细胞作实验。 (2)设实验组(0.5、1.0、2.0mmol/Thd)、阴性对照组(0.5％DMSO)及阳性对照组(0.2μmol/L STI571)作用于K562细胞，分别处理24h、48h、72h和96h。每次实验前所用细胞进行台盼兰染色，活细胞计数在85％以上。 (3)反应停对K562细胞增殖作用的影响：取对数生长期的K562细胞，调节细胞密度至2×105/mL，加入不同浓度药物，按每孔100μL接种于96孔板，分别培养24h、48h、72h和96h。然后加入MTT 10μL，继续培养4h后，加入二甲基亚砜(DMSO)10μL，在酶标仪上490nm处测吸光度值(A值)。每个浓度组设5个复孔，实验重复三次。最后由A值计算生长抑制率，并绘制生长抑制曲线。 (4)形态学观察：用Thd处理K562细胞72h后，Wright-Giemsa染色，光镜下观察K562细胞形态学变化，并照相记录。 (5)反应停对K562细胞凋亡率的影响：取对数生长期的K562细胞，细胞密度调节至2×105/mL，加入不同浓度药物，按每孔1mL接种于24孔板，分别培养24h、48h、72h和96h。收集细胞及上清液(上清液将用于检测VEGF)，重悬细胞，调整细胞密度为5×105～5×106/mL。AnnexinV-FITC/PI双染色后，FCM检测K562细胞的早期凋亡，其中FITC+/PI-为凋亡细胞；FITC+/PI+为继发性坏死细胞；FITC-/PI-为正常细胞：FITC-/PI+为坏死细胞。 (6)DNA琼脂糖凝胶电泳：将对数生长期的细胞用不同浓度药物处理72h后，收集细胞，按DNA提取试剂盒说明操作，提取DNA，1.8％琼脂糖凝胶电泳，观察DNA梯状条带(DNA ladder)，检测K562细胞的晚期凋亡。 (7)反应停对K562细胞VEGF表达的影响：采用酶联免疫(ELISA)的实验方法，对培养上清液中VEGF含量进行定量分析，观测反应停对VEGF表达的影响。 结果： (1)反应停抑制K562细胞增殖：反应停在0.5、1.0、2.0mmol/L 浓度时均能明显抑制K562细胞的增殖，存在明显浓度依赖关系。1.0、2.0mmol/L 浓度与阴性对照组比较差异显著(P<0.01)，而0.5mmol/L 浓度与阴性对照组比较无显著差异(P>0.05)。反应停在0.5、1.0、2.0mmol/L 浓度与阳性对照组比较差异显著，其抑制K562细胞增殖作用明显比伊马替尼(STI571)弱。 (2)反应停诱导K562细胞凋亡的形态学观察：反应停处理K562细胞72h后，细胞出现体积缩小，胞质空泡化，染色质浓缩、边集，核固缩，细胞边缘可见突起，脱落后形成凋亡小体。阴性对照组形态变化不明显，但阳性对照组出现了较典型的形态学变化。 (3)反应停诱导K562细胞凋亡的定量分析：流式细胞仪(FCM)结果显示：反应停在0.5、1.0、2.0mmol/L浓度时能诱导K562细胞凋亡，而且K562细胞凋亡率随Thd浓度增加和作用时间延长而升高，具有浓度和时间依赖性，与阴性对照组比较差异显著(P<0.01)，与阳性对照组比较同样具有明显差异(P<0.01)。 (4)DNA琼脂糖凝胶电泳：反应停作用于K562细胞72h后，提取DNA，进行DNA琼脂糖凝胶电泳，可见典型的DNA梯状条带，而阴性与阳性对照组均未见梯状条带。 (5)反应停下调K562细胞VEGF表达：反应停在0.5、1.0、2.0mmol/L 浓度时均能明显下调K562细胞VEGF的表达，存在明显浓度和时间依赖性，与阴性和阳性对照组比较，均具有显著差异(P<0.01)。 (6)VEGF与凋亡率之间的相关性：分析结果显示：反应停作用K562细胞一定时间后，在诱导K562细胞凋亡的同时，K562细胞VEGF的表达下调，K562细胞的凋亡率与VEGF表达水平呈负相关。 结论： (1)反应停能明显抑制K562细胞增殖，其作用呈浓度依赖性。 (2)反应停能有效地诱导K562细胞凋亡，其作用呈浓度和时间依赖性。 (3)K562细胞自身能分泌VEGF。 (4)反应停能下调K562细胞VEGF的表达，其作用呈浓度依赖性。 (5)K562细胞的凋亡率与VEGF表达水平呈负相关。 (6)反应停对K562细胞的增殖抑制作用可能与其诱导K562细胞凋亡和下调K562细胞VEGF表达有关。(7)反应停诱导K562细胞凋亡的机制可能与反应停下调VEGF表达有关。