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[研究目的和内容]miRNA(microRNA)是一类对基因进行转录后调控的小分子非编码RNA,参与多种生理和病理过程。近来研究表明,某些rniRNA具有癌基因或抑癌基因活性,这些miRNA能够通过负性调节靶基因的表达水平,在肿瘤发生和发展过程中发挥重要作用。本实验室利用胶质瘤芯片检测发现在人脑胶质瘤组织中hsa-miR-874(microRNA-874)表达水平发生明显下调。本课题进一步研究hsa-miR-874对胶质瘤细胞生长表型的影响,并确定miR-874直接作用的靶基因,以阐明hsa-miR-874对胶质瘤发生和发展发挥作用的分子机制。[方法]通过定量RT-PCR方法检测正常脑组织和胶质瘤组织中hsa-miR-874的表达水平,确认本研究组前期芯片的检测结果;检测人胶质瘤细胞系中(LN229、U87、SNB19、U251、LN308)hsa-miR-874 的表达。在人胶质瘤细胞系 LN229、U87细胞中,应用寡核苷酸hsa-miR-874 mimics转染2个胶质瘤细胞系后,利用MTT实验和集落形成实验检测细胞生长活性的变化,用Transwell实验检测胶质瘤细胞的侵袭能力,利用流式细胞仪检测细胞周期和凋亡变化。进一步采用TargetScan 5.1、STRING蛋白质相互作用网络、KEGG网络、miRNA靶向基因预测软件、RNAhybrid程序来寻找hsa-miR-874靶基因;应用寡核苷酸hsa-miR-874 mimics转染2个胶质瘤细胞系,并通过RT-PCR检测hsa-miR-874的表达效果,检测转染hsa-miR-874后目标基因的表达变化;应用荧光素酶报告试验证实miR-874的靶基因;最后应用Western blot检测转染hsa-miR-874后蛋白水平的表达变化,进一步验证hsa-miR-874对靶基因的调控作用。[结果]Hsa-miR-874在胶质瘤中表达明显低于正常脑组织。在人胶质瘤细胞系 LN229、U87、U251、LN308、SNB19 细胞中,LN229、U87 细胞中 hsa-miR-874表达水平明显低于其它细胞系。用寡核苷酸hsa-miR-874 mimics转染后,细胞生长明显受抑制,且集落形成能力明显降低,细胞转移能力降低。转染组细胞周期呈现GO/G1期阻滞,同对照组相比S期明显下降。靶基因筛选结果表明,作为一种癌基因,GLDC是hsa-miR-874的候选靶基因,其3’非翻译区包含hsa-miR-874的潜在结合位点。荧光报告载体实验证实hsa-miR-874能够通过作用于GLDC基因的3’非翻译区的特定位点,对其表达进行负性调节。而在导入hsa-miR-874胶质瘤细胞中,GLDC基因的mRNA表达水平略上升,蛋白表达水平有明显下降。[结论]hsa-miR-874在胶质瘤细胞系和胶质瘤标本中低表达,并与肿瘤病理分级呈负相关。通过生物信息学分析,荧光素酶实验和Western blot检测,证实GLDC基因为hsa-miR-874靶基因;我们发现hsa-miR-874过表达使得GLDC表达量明显下降。这些数据表明:hsa-miR-874很可能通过GLDC基因调控,使其在胶质瘤细胞中发挥抑癌作用。通过阐明hsa-miR-874在胶质瘤细胞中的具体作用机制有利于对恶性肿瘤的发生和发展进行深入的了解,同时也为肿瘤诊断和治疗提供新的线索。