人柯萨奇病毒A组6型(Coxsackievirus A6,CVA6)属于小核糖核酸(RNA)病毒科肠道病毒属,是引起手足口病(Hand foot and mouth Disease,HFMD)另一主要病原体之一。近几年,由CVA6引起的HFMD已在多个国家和地区广泛暴发和流行,成为一个重要的医学关注对象。CVA6除感染婴幼儿之外,也可感染免疫功能正常的成年人。在其流行季节,易与其他肠道病毒混合感染形成新型变异毒株。此外,也能通过基因重组的形式形成新型变异毒株。目前,针对CVA6尚无有效的抗病毒药物或疫苗。因此,建立合适的动物模型对于有关CVA6的基础研究、抗病毒药物研究及疫苗研发具有重要意义。本论文的研究为两部分。第一部分,建立CVA6病毒的细胞培养体系与核酸检测方法。首先对RD细胞进行培养,建立细胞培养体系,用于病毒培养、扩增;采用微量滴定法测定病毒的感染性滴度;纯化含有T7启动子的VP1基因片段,加“∧”尾,连接T载体,感受态细胞转化,提质粒并线性化,经体外转录获得RNA标准品,利用标准品建立标准曲线,并对建立的方法进行灵敏性、特异性和重复性评价。结果CVA6的感染性滴度为107.5CCID50/ml;建立的CVA6 TaqMan探针实时荧光定量 RT-PCR(real-ti me fl uorescence quantitative RT-PCR,RT-qPCR)方法具有较高的灵敏性、特异性和重复性。结论CVA6的感染性滴度可用于实验研究;建立CVA6 TaqMan探针RT-qPCR方法可用于检测CVA6病毒核酸中的拷贝数。第二部分,研究与探讨CVA6感染动物模型的可行性,并通过建立的动物模型分析感染CVA6后的免疫学、病理学和病原学等变化,初步探究其致病机制。选用与人类较为接近的恒河猴婴猴(3-4月龄),经呼吸道和消化道两种感染方式,以感染滴度为106.5CCID50/ml、感染剂量为100μl的CVA6病毒液感染恒河猴婴猴,构建CVA6感染动物模型。在恒河猴婴猴感染CVA6后逐日观察记录其临床表现,按时间点采集样品(血液、咽拭子、粪便),并对样品进行血常规、生化、细胞因子及中和抗体效价进行检测,通过CVA6 TaqMan探针RT-qPCR方法检测模型感染CVA6后样品中的病毒血症情况及主要组织器官中的病毒载量变化;利用中和试验检测抗体效价;通过病理切片观察各主要组织器官的病理变化。结果CVA6病毒可通过消化道(口腔)和呼吸道(鼻腔粘膜)感染方式引起恒河猴婴猴出现与人类HFMD相似的发热和唇部、前肢出现疱疹及脱皮等临床症状,血常规和生化检测均发生了相应改变;CVA6 TaqMan探针RT-qPCR方法检测血液、咽拭子、粪便中出现了典型的病毒血症和排毒情况,各组织器官中均有病毒载量,其中以各肠段和淋巴结中病毒载量最为高;通过病理切片观察,在皮肤疱疹病理组织中观察到有炎性细胞浸润及中性粒细胞和淋巴细胞出现,同时在不同组织器官(肝、肺、淋巴结、回肠等)有不同的病理改变;通过免疫组化方法在各组织中检测CVA6的抗原;同时,通过免疫学(补体、免疫球蛋白、细胞因子)检测,免疫学指标均有变化。结论CVA6病毒可感染3-4月龄恒河猴,出现手足口病临床症状;相关免疫细胞、免疫蛋白、免疫因子均发生变化;肝、肺及淋巴结等多器官出现病理样的改变。以上结果表明,CVA6病毒可在恒河猴机体内复制、增殖及被清除,该动物模型反映了一个完整的病毒感染过程。此外,该动物模型在构建过程中的检测结果对于CVA6的致病机制研究和疫苗及抗病毒药物的研制也给予了一定的提示。