研究目的胰岛素抵抗是代谢综合征、糖尿病和动脉粥样硬化的共同病理生理改变。糖尿病和代谢综合征的关系是复杂的,肥胖是中心环节。与肥胖有关的脂肪细胞因子通过调节免疫和炎症反应等途径参与胰岛素抵抗及其相关疾病如代谢综合征、2型糖尿病的发生、发展。脂肪细胞因子和胰岛素抵抗关系的确切机制还需深入阐明。Vaspin是一种新识别出来的内脏脂肪细胞因子,具有胰岛素增敏效应,最近的一些研究报道了用重组vaspin干预2型糖尿病鼠后明显改善了胰岛素抵抗和血糖水平,也抑制了一些将会促进胰岛素抵抗进展的基因表达。然而关于人体血清中vaspin怎样被调节以及与肥胖、胰岛素抵抗的关系还不清楚,有待于进一步研究。以NF-кB为网络中心的内皮细胞活化及炎症基因诱导途径参与2型糖尿病发病机制以及血管并发症和胰岛素抵抗相关疾病的发生发展是当今研究的热点。最近有报道,过度活化的NF-кB炎症通路是胰岛素抵抗的可能机制。深入研究NF-кB和胰岛素抵抗及其相关疾病的关系将有着重要的意义。如能早期诊断和预测肥胖个体发生代谢综合征的危险性将对临床治疗有很大的推动作用。通过2型糖尿病人群作为研究靶点,将观察脂联素、vaspin和代谢综合征临床表型各组分(国际糖尿病联盟IDF关于代谢综合征的诊断标准)的关系及脂联素、vaspin、脂联素与vaspin的比值(A/V)是否可以作为评估代谢综合征有用的指标。研究脂肪细胞因子,肥胖,胰岛素抵抗和代谢综合征的相互关系,进一步探索代谢综合征发生的危险性。肥胖,心血管疾病及与之相关的2型糖尿病和代谢综合征与系统性炎症有密切的关系,本次研究中也将深入观察在人类脐静脉内皮细胞中新发现的脂肪细胞因子vaspin将怎样作用血管内皮细胞NF-кB,和怎样影响NF-кB下游因子如细胞间黏附分子ICAM-1、血管细胞黏附分子VCAM-1和单核细胞趋化蛋白MCP-1,探讨vaspin是否通过影响炎症状态的平衡在胰岛素抵抗发生机制中产生重要作用,从而观察vaspin和胰岛素抵抗的关系。研究方法通过260例初诊2型糖尿病患者(126名男性、134名女性)研究脂联素、vaspin、A/V和肥胖、胰岛素抵抗和代谢综合征表型的关系。了解代谢综合征阴性和代谢综合征阳性患者的临床测量及代谢指标的变化。绘制ROC曲线分析脂联素、vaspin在代谢综合征中的诊断价值。以年龄、体重指数、腰围、腰臀比、收缩压、舒张压、胆固醇、甘油三酯、高密度脂蛋白胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇、空腹血糖、空腹胰岛素、糖化血红蛋白、稳态模型评估指数(HOMA-R)、脂联素、vaspin、A/V为自变量,是否代谢综合征为应变量,进行多因素Logistic回归分析,观察上述变量对代谢综合征的影响。非参数Spearman相关和多元回归分析观察脂联素、vaspin、A/V和胰岛素抵抗、肥胖、代谢变量的关系。瞬时转染原代脐静脉内皮细胞(HUVEC),以pNF-кB-1uc质粒和内参照β-gal质粒共转染,GFP质粒同时转染。β-gal活力测定为转染效率内参照,以β-gal的活性值校正相应细胞裂解液中NF-κB的化学发光强度,在此基础上建立一套高效率、稳定的脐静脉内皮细胞转染方法。从而准确的通过发光仪测定NF-κB荧光酶活力,即相对发光值(RLU)。pNF-кB-1uc报告质粒稳定转染脐静脉内皮细胞株EA.hy926(脐静脉内皮细胞和上皮癌细胞杂交的体细胞株),因转染用的质粒载体在哺乳动物细胞内表达hph基因,稳定转染用Hygromycin B压力筛选得到稳定表达pNF-кB-1uc质粒的EA.hy926同源细胞克隆。进而测定NF-κB的活力。NF-κB刺激因子—肿瘤坏死因子-α(TNF-α),激活NF-кB报告基因表达荧光素酶,再加入Bay11-7082(一种常用的NF-кB抑制剂,最终抑制依赖于NF-κB的基因转录),这种激活可被Bay11-7082所抑制。利用此方法检测不同浓度(0-3200ng/ml)vaspin是否能够激活NF-кB报告基因表达荧光素酶,及NF-кB的下游靶基因ICAM-1、VCAM-1和MCP-1。并且这种激活是否能被Bay11-7082所抑制。vaspin预培养后TNF-α干预人脐静脉内皮细胞,观察vaspin是否能够影响其它细胞因子对NF-κB激活。实时荧光定量聚合酶链反应(Real time-PCR)和免疫蛋白印迹(Western blot)观察vaspin作用后NF-κB下游因子ICAM-1、VCAM-1及MCP-1的mRNA和蛋白表达情况。同时在NF-кB抑制剂Bay11-7082参与下,观察NF-κB下游基因表达水平。每组实验均执行三次且为了保证实验的一致排除可能的干扰因素,在做干预实验前均换成无血清培养基后准备实验。实验结果运用SPSS16、Sigma Stat统计软件进行分析,数据描述采用均数±标准差,采用方差分析,T-test和LSD法两两比较。部分图表由Sigma plot绘制。研究结果2型糖尿病人群与正常人群相比血清脂联素水平是降低的,血清vaspin呈现升高的趋势(P<0.05),A/V减少(P<0.05)。血清vaspin在女性中蛋白表达水平增高。代谢综合征阳性病人相对于代谢综合征阴性病人有更多的致动脉粥样硬化形成因素,有较高的胰岛素抵抗和升高的Vaspin水平,降低的脂联素水平和降低的A/V。随着代谢综合征组分增多,血清vaspin水平逐渐增高,A/V及血脂联素水平逐步减少,当具备5个代谢综合征组分时vaspin最高,A/V和脂联素水平最低。ROC曲线分析vaspin,A/V对代谢综合征的诊断价值较高。vaspin与体重指数、腰围、腰臀比、甘油三酯、HOMA-IR、高密度脂蛋白胆固醇和空腹胰岛素有明显的相关性(P<0.01),脂联素除了和收缩压、舒张压、空腹血糖无明显相关外,与其它参数都有相关性(P<0.01)(P<0.05),A/V与所有研究参数都有明显的相关性(P<0.01)(P<0.05)。是否代谢综合征为应变量的多元Logistic回归分析中,自变量vaspin的OR:0.469(95%CI,0.252-0.873;P=0.017),A/V的OR:0.368(95%CI,0.171-0.791;P=0.010),脂联素的OR:0.279(95%CI,0.097-0.804;P=0018)。脂联素、vaspin、及它们的比值作为因变量,性别、是否肥胖、是否敏感、腰围、甘油三酯、高密度脂蛋白为自变量的多元回归分析中,当控制其它变量影响后,超重(肥胖)BMI≥25较非肥胖BMI<25的患者有较高的vaspin,和较低的脂联素和A/V。胰岛素敏感(HOMA<2)相对于胰岛素抵抗(HOMA≥2)时,有较低的vaspin水平,较高的脂联素水平和A/V。A/V或HOMA-R为因变量的多元回归分析中,A/V较HOMA-R与更多的研究变量有明显相关性(P<0.05)。A/V为因变量,性别、BMI、WC、TG、HDL为自变量的模型(校正的R2=0.692)有更好的拟和效果。经pNF-κB-Luc报告质粒稳定转染的EA.hy926细胞珠,0-3200 ng/ml的vaspin作用2小时,Vaspin激活了NF-κB的转录活性(P<0.05)。效应呈剂量依赖性(不同剂量之间的刺激活性相比有统计学意义即高浓度组较低浓度组刺激活性增高P<0.05)。同样观察到vaspin呈剂量依赖性激活了原代HUVEC中NF-κB转录活性(P<0.05)。0-3200ng/ml的vaspin预培养由pNF-κB-Luc报告质粒稳定转染EA.hy926细胞系不同的时间段,之后用10ng/ml TNFα作用2小时,TNFα介导的NF-κB转录活性被vaspin明显的抑制(P<0.05),呈剂量依赖性的抑制(P<0.05),预培养延长到24小时时,抑制TNFα介导NF-κB转录活性最强。0-3200ng/ml的vaspin作用人脐静脉内皮细胞株后,黏附分子ICAM-1,VCAM-1和趋化因子MCP-1的基因水平逐渐增强;先加入10μM Bay11-7082 1小时后再加入3200ng/ml的vaspin 4小时,ICAM-1,VCAM-1,MCP-1增高的mRNA被明显抑制,相比3200ng/ml的vaspin作用EA.hy926细胞珠,差异有统计学意义(p<0.05)。不同浓度vaspin作用EA.hy926细胞株和原代HUVEC,ICAM-1、VCAM-1和MCP-1的蛋白表达随着vaspin浓度的递增依次增高。10μM的Bay11-7082预培养后,Bay11-7082明显降低了TNFα介导的黏附分子ICAM-1,VCAM-1和趋化因子MCP-1的蛋白表达,也明显降低了vaspin介导的ICAM-1,VCAM-1和MCP-1蛋白表达。结论该研究从脂联素和vaspin与胰岛素抵抗和2型糖尿病患者代谢综合征临床表型的关系和vaspin对脐静脉内皮细胞NF-κB及下游基因影响两方面探讨了脂肪细胞因子在胰岛素抵抗中的可能作用。研究结果揭示脂联素、vaspin及脂联素与vaspin的比值(A/V)和肥胖、胰岛素抵抗密切相关,也与代谢综合征有紧密的联系,vaspin参与了胰岛素抵抗的发生;在此基础上采用瞬时转染、稳定转染、RT-PCR和Western blot等手段,从分子生物学层面观察并阐明vaspin在原代脐静脉内皮细胞和EA.hy926细胞珠体外培养过程中激活了NF-κB及其下游炎性因子,提示脂肪细胞因子是调节炎症反应的新靶点,vaspin激活NF-κB在胰岛素抵抗中发挥重要作用;同时研究也观察到vaspin抑制了TNF-α介导的NF-κB活性,显示其作用的复杂性,为今后进一步的理论和临床实践提供了新的思路。