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研究背景及目的:慢性肾脏病（Chronic Kidney Disease,CKD）是世界范围内的公共健康问题,给全球带来了严重的经济负担。心血管疾病（Cardiovascular diseases,CVD）是CKD患者最常见的并发症和主要的死因,且随着疾病的进展,心血管事件的发生率和死亡率进一步增加。在CKD中血管钙化极其常见,据报道,血管钙化是CKD患者CVD发生和死亡的独立危险因素,但CKD血管钙化的具体机制还不清楚。研究发现TGF-β1诱导血管钙化的发生发展,我们的前期研究也发现,COX-2参与介导血管钙化这一过程。本研究主要探讨TGF-β1在血管钙化中的作用及其机制,探究COX-2在TGF-β1诱导的血管钙化过程中的作用及其机制,以及评价COX-2抑制剂-美洛昔康对肾衰模型大鼠肾损伤和血管钙化的作用,为临床血管钙化的预防和治疗提供新的靶点,对减少CKD患者心血管事件的发生和死亡以及提高患者生存质量有重要意义。实验方法:1.体外实验（1）原代SD大鼠主动脉VSMCs提取。（2）高磷诱导VSMCs钙化,qPCR和Western Blot检测TGF-β1m RNA和蛋白表达情况以及COX-2和β-catenin、GSK3β、p-GSK3β蛋白水平变化,荧光素酶报告质粒检测高磷对TGF-β1信号的影响。（3）腺病毒TGF-β1处理VSMCs,qPCR和Western Blot检测成骨指标Runx2、OPN以及VSMCs标记α-SMA、SM22αm RNA和蛋白表达情况,同时检测COX-2、β-catenin、GSK3β、p-GSK3β、Sclerostin和c-myc蛋白水平变化;免疫荧光检测β-catenin蛋白表达;茜素红染色检测VSMCs钙化情况;腺病毒TGF-β1处理SD大鼠主动脉环,14d后进行硝酸银染色,检测主动脉环钙化情况。（4）对VSMCs进行如下处理:对照、Ad TGF-β1、NS398（COX2抑制剂）、Ad TGF-β1+NS398,qPCR和Western Blot检测成骨指标Runx2、OPN以及VSMCs标记α-SMA、SM22αm RNA和蛋白表达情况,同时检测β-catenin、GSK3β、p-GSK3β、Sclerostin蛋白表达情况;对SD大鼠主动脉环做同样处理,14d进行硝酸银染色,检测主动脉环钙化情况。（5）腺病毒TGF-β1处理VSMCs,免疫沉淀（IP）检测p-Smad2/3与p-CREB之间的相互作用;染色质免疫共沉淀（CHIP）检测p-Smad2/3或p-CREB在Sclerostin和β-catenin启动子区域的募集情况。2.体内实验（1）0.75%腺嘌呤饮食诱导SD大鼠肾衰模型;（2）大鼠随机分为6组:对照组（正常饮食6W）,低剂量预防组（0.75%腺嘌呤饮食+1mg/kg美洛昔康6W）,高剂量预防组（0.75%腺嘌呤饮食+6mg/kg美洛昔康6W）,模型组（0.75%腺嘌呤饮食6W）,低剂量治疗组（0.75%腺嘌呤饮食6W后,胃内给药1mg/kg美洛昔康20d）,高剂量治疗组（0.75%腺嘌呤饮食6W后,胃内给药6mg/kg美洛昔康20d）。（3）每个实验终点,处死大鼠,测量体重,收集眼眶静脉血,检测血生化指标:钙（Ca）、磷（Pi）、尿素氮（BUN）、肌酐（Scr）,同时ELISA实验检测血清中TGF-β1与COX-2的表达情况;取大鼠肾脏标本做HE染色看肾脏的病理改变情况;取大鼠胸主动脉,Western Blot检测TGF-β1与COX-2蛋白表达情况,硝酸银染色,检测每组大鼠血管的钙化情况。3.临床样本收集（1）收集重庆医科大学附属第一医院肾脏内科CKD患者血液样本,分为2组:CKD非透析患者和CKD透析患者。以下是该研究的纳入和排除标准:纳入标准:KDOQI分期三期及以上即:肾小球路过滤（GFR）≤60ml/（min·1.73m2）;排除标准:（1）有慢性基础疾病;有传染性疾病,如乙型肝炎、梅毒等;（2）长期服用影响骨代谢的药物;（3）严重贫血或有出血性疾病,如:弥漫性血管内凝血、血栓性血小板减少性紫癜等;（4）严重心血管疾病;（5）昏迷患者;（6）未经知情同意。特别说明:该研究在进行前均取得各位患者知情同意以及签字后才实施,且已通过重庆医科大学附属第一医院伦理审查委员会审查。（2）清晨空腹安静状态下,透析患者在未透析之前采血;（3）采血前仔细核对病人的姓名、性别、年龄、床号和住院号;（4）采血后在室温下静置2小时,低温（4℃）、3500rmp离心5min,收集血清,并于-80℃保存样本;（5）血生化检测:钙（Ca）、磷（Pi）、尿素氮（BUN）、肌酐（Scr）（6）ELISA检测收集血清样本中TGF-β1、COX-2以及Sclerostin的表达情况。（7）本研究开始共计有175里患者参与,经排除标准筛选后共计96例患者入选。结果:1.体外实验结果（1）高磷诱导VSMCs钙化中,TGF-β1的m RNA和蛋白水平上调,以及TGF-β1信号转录活性增强,同时COX2和β-catenin、p-GSK3β蛋白水平上调,GSK3β蛋白水平无改变;（2）TGF-β1能上调VSMCs中Runx2、OPN的m RNA和蛋白水平,下调α-SMA、SM22αm RNA和蛋白水平,TGF-β1能诱导VSMCs和大鼠主动脉环钙化。TGF-β1在诱导VSMCs钙化过程中,上调COX2和β-catenin、p-GSK3β蛋白水平,下调Sclerostion表达,GSK3β蛋白水平无改变;（3）COX-2抑制剂NS398能降低TGFβ对Runx2、OPN表达的上调以及减少TGFβ对α-SMA、SM22αm RNA的下调作用。NS398能减少TGF-β1诱导的VSMCs和大鼠主动脉环钙化。NS398能降低TGFβ上调的β-catenin、p-GSK3βm RNA和蛋白水平,以及增加TGFβ下调的Sclerostion m RNA和蛋白水平。对GSK3β表达水平无改变。（4）IP和CHIP实验结果显示,TGF-β1处理VSMCs后,p-Smad2/3与p-CREB相互作用,p-Smad2/3与p-CREB在Sclerostion或β-catenin的启动子区域募集。2.体内实验结果（1）体重测量结果:与对照组相比,模型组大鼠体重明显下降,而治疗组大鼠体重较模型组有明显改善。（2）血清生化结果:模型组大鼠血清中Ca、Pi、BUN、Scr明显高于对照组,预防组大鼠血清中Ca、Pi、BUN、Scr高于治疗组但都低于模型组。（3）ELISA实验结果显示:模型组大鼠血清中COX-2和TGF-β1蛋白水平高于对照组。（4）HE染色结果显示:对照组大鼠肾脏结构正常,肾小球、肾小管及间质无异常改变;模型组大鼠肾脏病理改变明显:肾小球数量明显减少,肾小管扩张,管内有棕褐色晶体物质沉积,间质区域增宽,间质纤维组织增生,纤维化比较明显;预防组肾脏病理改变较模型组稍微改善一些;而治疗组肾脏病理得到一定程度的改善。（5）大鼠胸主动脉组织检测结果:WB结果显示,与对照组相比,模型组大鼠胸主动脉组织中,COX-2和TGF-β1蛋白水平明显高于对照组;硝酸银染色结果表明,模型组大鼠血管可见明显的钙化,预防组血管钙化改善不明显,治疗组血管钙化得到明显改善。3.临床样本检测结果（1）血清生化的分析结果:所有参与该研究的患者BUN及Scr水平均达到CKD KDOQI 5期,血磷水平明显升高,血钙水平降低。（2）ELISA实验结果:进行血液透析的CKD5期患者血清中COX-2和TGF-β1明显低于非透析CKD5期患者;非透析患者血清中Sclerostin水平明显低于CKD透析患者。结论:1.高磷诱导VSMCs钙化过程中,促进TGF-β1表达并且激活TGF-β1信号。2.TGF-β1可诱导VSMCs成骨分化以及胸主动脉钙化,同时也能促进高磷诱导的VSMCs钙化。3.高磷和TGF-β1在促进VSMCs钙化过程中,激活Wnt/β-catenin信号通路。4.高磷和TGF-β1在促进VSMCs钙化过程中,COX-2表达上调;抑制COX-2后能明显抑制高磷和TGF-β1诱导的VSMCs钙化。5.COX-2参与调节高磷与TGF-β1对Wnt/β-catenin信号通路的激活,抑制COX-2后高磷和TGF-β1激活Wnt/β-catenin信号作用明显减弱。6.在体内大鼠肾衰模型中,COX-2抑制剂-美洛昔康能明显减轻血管钙化,同时肾脏损伤得到一定程度的改善。