PARP是一种存在于多数真核细胞中的具有催化聚ADP核糖化的细胞核酶,参与蛋白质的翻译后修饰。该酶系至少具有18个成员,其中,PARP1是第一个被发现的亚型,也是目前研究最为深入、已知功能最多的一个,在该家族所占比例最多,发挥着90%以上的作用。PARP1功能包括DNA损伤修复、DNA甲基化、染色质重塑、细胞凋亡、维持基因组稳定性、细胞信号转导及参与许多促炎因子的转录调节等作用,其中PARP1最主要的功能是参与DNA损失修复。当细胞发生DNA损伤时,PARP1可以识别并结合到断裂的DNA链上,然后通过募集烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(Nicotinamide adenine dinucleotide,NAD)依赖的ADP核糖单位、组蛋白及各种DNA修复通路中的相关酶,通过一系列的催化调节反应,完成DNA损伤修复过程,因此PARP1被认为是DNA损伤的感受器。组蛋白可以被PARP1核糖化修饰,使其从染色质上解离下来,从而有助于DNA损伤修复蛋白结合到DNA损伤位点,进行DNA损伤修复。目前,肿瘤细胞的耐药机制主要归功于DNA损伤修复能力的增强,鉴于PARP1在DNA损伤修复中的重要作用,因此临床上有许多研究把PARP1作为肿瘤治疗靶点,选用PARP抑制剂单独或与其他化疗药物联合用于治疗多种肿瘤。PARP抑制剂可导致DNA单链修复缺陷,DNA单链损伤得不到修复进而累积造成DNA双链断裂,正常细胞可以通过同源重组进行双链DNA修复;而具有BRCA1或BRCA2突变的肿瘤细胞则不能通过同源重组修复断裂的DNA双链,最后导致肿瘤细胞合成致死。有研究表明,PARP抑制剂对同源重组功能正常的卵巢癌也有抑瘤作用,提示PARP抑制剂除了参与破坏DNA损伤修复之外,可能还有其他途径发挥抗肿瘤的作用。鉴于PARP参与调节染色质重塑和转录等其他重要的生物学过程,可以推测PARP抑制剂的抗肿瘤作用机制不仅限于干扰DNA损伤修复。因此有必要明确它在抗肿瘤中的其他作用机制。PARP1功能抑制除了对肿瘤细胞有直接杀伤作用外,可能也影响肿瘤赖以生存的肿瘤微环境。因此,我们从两个角度研究PARP1功能抑制的抗肿瘤机制:肿瘤细胞本身和肿瘤微环境。我们发现PARP1功能抑制不仅可以通过诱导氧化应激降低肿瘤细胞增殖,还可以通过阻碍肿瘤相关巨噬细胞M2极化影响肿瘤赖以生存的微环境。第一部分PARP1功能抑制通过诱导氧化应激阻碍卵巢癌细胞增殖卵巢癌是女性生殖系统常见的恶性肿瘤之一,死亡率居于类妇科肿瘤之首,严重威胁着女性身体健康。卵巢癌发病隐匿,早期很少有症状,就诊时约70%已属晚期,大都已伴有远处转移,手术难以完全清除癌灶,错过最佳诊疗时间。卵巢癌病人的术后预后很差,据2018年美国癌症协会最新统计其5年总体生存率约 47%。目前,PARP抑制剂在卵巢癌治疗方面已经得到了广泛的应用,且不限于有同源重组功能缺陷的肿卵巢癌。为了了解PARP1在卵巢癌中的作用,我们首先检测了 PARP1在94例高级别浆液性卵巢癌(HGSOC)和26例匹配的输卵管(FT)组织中的表达情况,发现与FT组织相比,PARP1在HGSOC中表达显著升高。同时我们在6个不同卵巢癌细胞系中检测PARP1的表达情况,同样也发现与正常输卵管上皮细胞(FTE-187)相比,PARP1在卵巢癌细胞中高表达。为了研究PARP1在卵巢癌高表达的生物学意义,我们用PARP抑制剂PJ-34处理卵巢癌细胞,检测细胞周期分布和克隆形成情况,发现PARP1抑制导致卵巢癌细胞G2停滞及克隆形成能力下降。鉴于许多抗肿瘤药物通过升高癌细胞的活性氧(ROS)水平导致细胞周期停滞或细胞死亡,我们检测了 PARP抑制剂PJ-34对卵巢癌细胞ROS水平的影响。我们用PJ-34处理不同的卵巢癌细胞系,发现PARP1抑制不仅导致卵巢癌细胞DNA损伤增加,而且升高了卵巢癌细胞的ROS水平。临床上常用的两种PARP抑制剂Niraparib和Olarparib同样也可以升高卵巢癌细胞ROS水平。更为重要的是,抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸(NAC)可以拯救由PARP1抑制或缺失造成的DNA损伤和增殖抑制,表明ROS水平升高可部分介导PARP抑制剂的移肿瘤作用。进一步研究发现,PARP1抑制可以上调NADPH氧化酶NOX1和NOX4表达水平,并且部分介导ROS水平的升高。在体内实验中,我们发现NOX1和NOX4抑制剂GKT137831有效拯救了 PARP抑制剂PJ-34引起的裸鼠体内A2780异种移植瘤的增殖,并伴随着氧化碱基损伤的减少。敲低NOX1和NOX4同样减弱了裸鼠体内A2780-shPARP1卵巢癌细胞形成的异种移植瘤的氧化性DNA损伤,并大部消除了 PARP1缺失导致的生长抑制作用。我们的研究结果表明,PARP1功能抑制除了破坏肿瘤细胞DNA损伤的修复外,还可以通过提高卵巢癌细胞的氧化应激而发挥额外的抗肿瘤作用。第二部分PARP1功能抑制通过降低肿瘤相关巨噬细胞M2极化发挥抑瘤作用肿瘤微环境是肿瘤所处的内环境,由肿瘤细胞本身、基质细胞、微血管、组织液,基质外细胞等组成。肿瘤微环境中的基质细胞(如骨髓来源的抑制性细胞,巨噬细胞,内皮细胞,间充质细胞)和分泌因子可促进肿瘤组织的血管化,可以使肿瘤细胞发生免疫抑制作用,增加肿瘤对逆境的耐受能力。早期许多文章提示PARP1参与炎症调控。我们推测PARP1功能抑制也可能通过改变肿瘤微环境中的肿瘤相关巨噬细胞极化影响肿瘤进展。为此,我们以Parp1+/+和Parp1敲除小鼠为研究对象,构建EL4小鼠淋巴瘤移植模型。我们观察到,与Parp1+/+小鼠相比,EL4移植瘤在Parp1敲除小鼠中生长缓慢并且具有较低的肿瘤相关巨噬细胞(TAMs)累积。利用磁珠分选技术分选出Parp1+/+和Parp1敲除小鼠移植瘤中的TAMs,PT-PCR检测TAMs的极化情况,发现TAMs的M2极化在Parp1敲除小鼠的移植瘤中受阻。这些结果表明PARP1是TAMs累积及其M2极化所必需的。为了进一步了解PARP1在巨噬细胞M2极化中的功能,我们利用RNA-seq对Parp1+/+和Parp1敲除小鼠的腹腔巨噬细胞进行了表达谱分析。KEGG富集分析发现多个发挥促瘤作用的信号通路在Parp1敲除小鼠的腹腔巨噬细胞发生明显的表达下调,如炎症相关通路(NF-κB信号通路,Jak-STAT信号通路,细胞因子-细胞因子受体相互作用,趋化因子信号通路)。对RNA-seq结果进一步分析发现,在Parp1敲除小鼠腹腔巨噬细胞中M2标志基因的基础表达水平下调。免疫组化方法检测了小鼠EL4移植瘤中CD31、F4/80和Arg1的表达情况,结果发现,Parp1敲除小鼠EL4移植瘤中新生血管和肿瘤相关巨噬细胞减少及Arg1表达下降。这些结果进一步显示PARP1参与促进EL4移植瘤中TAMs的累积及M2极化。有研究表明乳酸促进巨噬细胞的M2极化。因此,我们接下来检测PARP1是否参与乳酸诱导的巨噬细胞M2极化。我们发现PARP在乳酸处理的巨噬细胞中被激活,而乳酸诱导的M2极化在Parp1敲除小鼠的巨噬细胞中受损。此外,PARP抑制剂PJ-34还可以抑制乳酸诱导的巨噬细胞的M2极化。这些结果表明PARP1也介导了乳酸诱导的巨噬细胞M2极化。巨噬细胞与EL4肿瘤细胞共同接种在Parp1敲除小鼠皮下,发现Parp1+/+小鼠腹腔巨噬细胞比Parp1敲除小鼠腹腔巨噬细胞形成的移植瘤更大,同时乳酸刺激的Parp1+/+小鼠腹腔巨噬细胞比乳酸刺激的Parp1敲除小鼠腹腔巨噬细胞形成的移植瘤更大。有研究表明缺氧诱导因子HIF-1α可以调控巨噬细胞M2极化,我们进而检测了 PARP1对巨噬细胞M2极化的正调控是否由HIF-1α介导,发现当PARP1被抑制时HIF-1α下调。ChIP实验表明PARP1可以与HIF-1α的启动子结合。以上结果表明,PARP1可以通过促进肿瘤相关巨噬细胞M2极化发挥促瘤作用。以上二部分结果揭示了 PARP抑制剂抗肿瘤作用的两个新机制。抑制PARP1 一方面可以诱导肿瘤细胞的DNA氧化损伤抑制细胞增殖;另一方面可以通过阻断肿瘤相关巨噬细胞的M2极化抑制肿瘤的生长。这些发现对推广PARP抑制剂在肿瘤治疗中的应用具有重要的参考价值。