研究背景乳腺癌多药耐药已成为阻碍肿瘤化疗进程和预后的最严重问题。阿霉素（Dox）是临床上治疗乳腺癌的一线化疗药物,但其单用抑制肿瘤效果并不完全,尤其在乳腺癌晚期,乳腺癌细胞发生耐药后,更易发生侵袭转移,给临床治疗增加了难度。因此,如何有效地逆转乳腺癌对阿霉素的耐药性进而改善乳腺癌患者的临床症状就成为重中之重。MicroRNA（miR）是一类长度约为18～25个核苷酸左右的小分子非编码RNA,通过与靶基因结合,从而抑制其功能。miR的表达失衡与多种疾病存在相关性。有研究人员提出它们可以为癌症的治疗提供新的治疗靶点。最近的研究表明,miR在癌症的化疗耐药中也发挥着关键作用。microRNA34a（miR34a）已被证实不仅可以通过多个靶点如Bcl-2,CD44,C-MET,SIRT1,CDK,MYC等参与各种肿瘤的发生发展,还通过多种信号通路（PI3K/Akt,Ras/Raf/Mek,Notch）参与多种肿瘤的多药耐药。但是由于miR靶点众多,关于其调控耐药的机制研究尚不清楚。基于上述研究背景,我们推测miR34a与阿霉素联用可能提高耐药乳腺癌细胞对阿霉素的敏感性。本课题一方面将探索miR34a是否能逆转乳腺癌对阿霉素耐药,二者合用是否能协同抑制阿霉素耐药乳腺癌的进展及作用机制并寻找miR34a发挥逆转耐药作用的关键靶点;另一方面,由于miR34a本身极易降解不稳定,且由于其带负电不易进入细胞膜,故在体内应用时受到很大限制。为了解决miR34a易降解、不易进入细胞的缺点,拟构建共载miR34a和Dox的纳米给药系统,以期提高miR34a的稳定性,在体内二者发挥协同逆转乳腺癌耐药的作用。第一部分miR34a逆转乳腺癌对阿霉素耐药的作用及机制研究研究目的:观察miR34a与Dox合用是否协同抑制耐药乳腺癌的进展并揭示其作用机制。研究方法:本研究采用人乳腺癌MCF-7细胞和耐阿霉素人乳腺癌MCF-7/A细胞作为体外实验研究对象,体内采用SPF级BALB/c-nu裸鼠腋下接种人MCF-7/A细胞建立移植瘤模型。1)采用miR过表达技术检测miR34a对耐药乳腺癌MCF-7/A细胞的增殖、侵袭、迁移和粘附的作用;2)研究miR34a逆转MCF-7/A细胞对阿霉素耐药的作用及分子机制:MTT法检测MCF-7/A细胞对敏感细胞的耐药倍数,确定耐药特性;检测三种浓度miR34a和Dox联合给药时的逆转倍数,筛选最适浓度下对耐药乳腺癌细胞增殖、凋亡、侵袭转移的作用;采用MTT法检测二者合用对MCF-7/A细胞增殖的作用,采用Hoechst染色法和Annexin V/PI双染法检测二者合用对MCF-7/A细胞凋亡的影响,采用划痕、Transwell法检测二者合用对MCF-7/A细胞侵袭转移作用的影响,并采用Western blotting法检测miR34a和Dox联用对增殖/凋亡关键蛋白（Bcl-2、Bax、Cleaved PARP）、迁移相关蛋白（E-cadherin、N-cadherin、CD44）、耐药相关蛋白（P-gp、MRP、GST-π、BCRP、Top2A）表达水平的变化;3)探索miR34a影响Dox耐药乳腺癌细胞的生物学效应变化的关键靶点:通过miRDB软件预测miR34a影响耐药的关键靶点,采用miR34a过表达手段过表达靶基因,采用Western blotting和RT-PCR方法检测miR34a是否对该靶基因存在调控作用,采用质粒过表达方法或siRNA干扰方法检测该靶基因对乳腺癌细胞或耐药细胞增殖、侵袭和转移的作用。采用Western blotting方法检测该靶基因对侵袭转移相关蛋白E-cadherin、N-cadherin表达水平的影响。采用双荧光素酶报告基因检测系统验证miR34a和靶基因的关系;4)检测 miR34a 和 Dox 合用对 Notch/NF-κB 和 Ras/Raf/Mek/Erk 信号通路的影响,并引入Notch抑制剂DAPT,NF-κB抑制剂PDTC,Ras抑制剂salirasib和Mek的抑制剂pimasertib验证miR34a和Dox合用对该通路的调控作用及与靶蛋白的关系;5)建立BALB/c-nu裸鼠皮下MCF-7/A荷瘤模型,研究miR34a和Dox合用是否能协同抑制乳腺癌的进展,实验结束提取瘤块,Western blotting验证Bcl-2、Bax等相关蛋白的表达是否与体外一致,瘤块冷冻切片后免疫荧光和免疫组化检测二者合用是否对该靶蛋白具有调控作用。实验结果:1)与敏感MCF-7细胞相比,Dox耐药MCF-7/A细胞更容易发生侵袭转移和粘附,Western blotting结果显示,E-cadherin蛋白表达在MCF-7/A细胞中显著下调,而N-cadherin和CD44蛋白表达在MCF-7/A细胞中显著上调。2)与敏感MCF-7细胞相比,Dox耐药MCF-7/A细胞中miR34a表达显著降低,MCF-7/A 细胞转染 50 nM,100 nM 和 150 nM miR34a mimics 后,可显著提高MCF-7/A细胞内miR34a的表达。miR34a可剂量依赖性抑制MCF-7/A细胞的增殖、侵袭和转移以及与HUVEC细胞的粘附。miR34a可显著升高E-cadherin的表达,显著降低N-cadherin和CD44的表达。3)MCF-7/A耐药细胞对MCF-7敏感细胞的耐药倍数约为24.98,25 nM、50 nM和100 nM miR34a与不同浓度的Dox合用后导致Dox的IC50由单用时的106.17降至合用时的41.35,29.28和14.08 μM,相应的逆转耐药倍数（协同指数）为 2.57,3.63 和 7.54。10 μM Dox 和 100 nM miR34a 合用可显著抑制 MCF-7/A细胞的增殖和促进凋亡。二者合用可降低Bcl-2/Bax蛋白的比例,升高Cleaved PARP蛋白的表达。4)10 μM Dox 和 100 nM miR34a 合用对经典耐药蛋白 P-gp、GST-π和 MRP的蛋白表达没有显著影响,但可显著降低BCRP和Top2A的蛋白表达,且可以抑制P-gp的外排功能。5)7 μM Dox和100 nM miR34a合用可显著抑制MCF-7/A细胞的侵袭和转移,且二者合用可上调E-cadherin的表达,下调N-cadherin的表达。6)7 μM Dox和100 nM miR34a合用可显著降低Snail的胞内表达。miR34a可在蛋白和mRNA水平降低Snail的表达。miRDB靶点预测网站显示Snail和miR34a存在碱基互补配对结合序列,进一步的双荧光素酶报告基因检测系统显示仅有miR34a和野生型Snail共转染组可显著降低荧光素酶的相对比值,说明在MCF-7/A细胞中miR34a可直接靶向Snail。7)采用小干扰RNA技术干扰（敲除）耐药MCF-7/A细胞内Snail,检测对细胞增殖、侵袭转移、粘附的影响,Western blotting和免疫荧光实验结果验证了Snail的成功干扰,细胞增殖结果显示Snail的敲除对MCF-7/A细胞的增殖没有显著影响,但可显著抑制MCF-7/A细胞的侵袭、转移和粘附,此外干扰Snail可显著下调N-cadherin、CD44的蛋白表达水平,上调E-cadherin的蛋白表达水平。挽救实验结果显示干扰Snail后转染miR34a并不会进一步抑制MCF-7/A细胞的侵袭转移。相反,采用质粒过表达技术过表达敏感MCF-7细胞内Snail,检测对细胞增殖、侵袭转移、粘附的影响,Western blotting、qRT-PCR和免疫荧光实验结果验证了 Snail的成功上调,细胞增殖结果显示Snail过表达对MCF-7细胞的增殖没有明显影响,但可显著促进MCF-7细胞的侵袭、转移和粘附,且过表达Snail可明显下调敏感细胞MCF-7中E-cadherin的蛋白表达水平,上调N-cadherin和CD44的蛋白表达水平。8)信号通路研究结果显示Dox和miR34a合用可抑制Notch、NF-κB、pan-Ras、k-Ras、Raf、p-Mek 和 p-Erk 的蛋白表达,加入 Notch 抑制剂 DAPT,NF-κB 抑制剂 PDTC,Ras 抑制剂 salirasib 和 Mek 抑制剂 pimasertib 后,Dox 和 miR34a可剂量依赖性抑制Notch、NF-κB、pan-Ras和p-Mek以及Snail的蛋白表达。9)Dox和miR34a合用在体内可显著抑制裸鼠荷MCF-7/A乳腺癌的进展,二者合用可降低Bcl-2/Bax和Snail的表达,升高PARP的表达,免疫荧光和免疫组化结果显示Dox和miR34a合用组Snail的蛋白表达显著降低。小结:miR34a可显著提高耐药乳腺癌细胞对Dox的敏感性,Dox和miR34a合用可显著抑制耐药乳腺癌细胞的增殖、侵袭和转移,诱导细胞凋亡,并抑制体内耐药乳腺癌细胞的增殖。二者发挥协同抗耐药乳腺癌的作用机制是通过直接调控Snail或通过Notch/NF-κB和Ras/Raf/Mek/Erk信号通路来调控Snail而实现。第二部分CD44靶向共轭亚油酸接枝壳聚糖共载miR34a和Dox纳米给药系统的构建及其抗耐药乳腺癌的药效学评价研究目的:作为一种microRNA（miR）,miR34a本身极易降解不稳定,且由于其带负电不易进入细胞膜,故在体内应用时受到很大限制。为了解决miR34a易降解、不稳定、不易进入细胞的缺点,我们针对乳腺癌耐药细胞表面高表达CD44受体的特点,设计了基于壳聚糖（CS）的共载Dox和miR的纳米载药系统,并进行透明质酸（HA）靶向修饰以提高对耐药乳腺癌细胞的靶向性,以期为miR34a和Dox合用治疗耐药乳腺癌提供有潜力的策略和实验基础。研究方法:首先考察了壳聚糖是否可以荷载miR34a进入乳腺癌细胞,上调miR34a的表达,发挥相应的生物学效应（如抑制增殖、侵袭和转移）。然后构建共轭亚油酸修饰壳聚糖（CLA-CS）共载体,荷载Dox和miR34a后,在纳米粒表面修饰HA,制备CD44靶向纳米粒即CCmDH NPs,考察CCmDH NPs的粒径电荷,对Dox和miR34a的荷载能力,以乳腺癌耐药细胞MCF-7/A为研究对象,研究其对MCF-7/A细胞的生物学功能,构建裸鼠移植瘤模型,体内进行药效学评价。1)利用离子凝胶法制备CS/miR34a NPs,采用透射电镜、粒径电位测定仪对CS/miR34a NPs的形态、粒径和电位进行考察,采用qRT-PCR、荧光显微镜和流式细胞仪检测CS/miR34a NPs是否能入胞,并进行细胞功能（细胞增殖、侵袭和转移）方面的评价。2)利用酰胺反应合成CLA-CS,采用1H-NMR和FT-IR验证CLA-CS的成功合成,计算CLA的修饰率。采用自组装方法制备CLA-CS空白纳米粒,DoxHCl经脱盐酸后采用超声制备载药纳米粒,通过静电吸附作用将miR34a和HA依次吸附在载药纳米粒表面,制备CCmDH NPs。3)采用TEM和粒径测定仪对CCmDH NPs进行形态观测,并测定粒径和电位。采用紫外分光光度计检测纳米粒对Dox的包载,测定载药量和包封率。采用动态模透析法测定Dox在pH5.5和pH7.4 PBS中从CCmDH NPs中释放情况。采用琼脂糖凝胶电泳检测纳米粒对miR34a的包载,并检测CCmDH NPs是否能抵抗RNase和血清的降解。4)采用Fam标记的miR34a制备HA修饰的共载Dox和Fam-miR34a的纳米粒,使用荧光显微镜和流式细胞仪检测CCmDH NPs是否能被MCF-7/A细胞摄取。使用Western blotting实验检测MCF-7/A与MCF-7细胞之间CD44受体表达情况,并使用荧光定量PCR技术检测CCmDHNPs是否能使MCF-7/A细胞内miR34a的水平升高。5)检测CLA-CS对正常细胞HUVEC是否具有毒性,检测相同Dox剂量下游离Dox和CCmDH NPs对MCF-7/A细胞增殖的作用,采用Hoechst染色法检测游离Dox和CCmDH NPs对MCF-7/A细胞凋亡的影响,并采用Western blotting实验检测凋亡相关蛋白cleaved PARP和Bcl-2的蛋白表达变化,采用划痕法和Transwell法检测游离Dox和CCmDH NPs组对MCF-7/A细胞侵袭和转移作用的影响,并采用Western blotting实验检测转移相关蛋白E-cadherin、N-cadherin、MMP2、CD44和Snail表达水平的变化。6)采用小动物活体成像仪检测游离Dox和CCmDH NPs经荷MCF-7/A瘤裸鼠尾静脉注射,并在单次给药96 h后剖出心肝脾肺肾和肿瘤,采用活体成像系统检测各组织器官和肿瘤是否仍有Dox残留,评价是否具有肿瘤靶向性。在构建裸鼠移植瘤后,分别给予生理盐水,miR34a,Dox,CCmD NPs和CCmDH NPs后,评价各组抗肿瘤效果,计算抑瘤率,提取瘤块蛋白,Western blotting实验检测各组与凋亡和侵袭转移相关主要蛋白Bcl-2,Bax,Snail,E-cadherin和N-cadherin的表达变化,采用免疫组化和免疫荧光检测Snail的表达。在信号通路方面,采用 Western blotting 检测 Notch/NF-κB 和 Ras/Raf/Mek/Erk 信号通路主要蛋白的表达,阐明CCmDH NPs发挥抗耐药乳腺癌作用的机制。实验结果:1)制备的CS单独荷载miR34a的纳米给药系统,其平均粒径约为135 nm,表面电势约为34 mV,且该纳米粒具有良好的稳定性,可抵抗血清和RNase的降解,保存2周,粒径变化不大。体外转染实验显示CS/miR34a NPs可被MDA-MB-231细胞摄取,导致细胞内miR34a的表达显著升高。体外细胞评价实验结果表明该CS/miR34a NPs可抑制MDA-MB-231细胞的增殖、侵袭和迁移。2)利用酰胺反应合成了 CLA-CS,1H-NMR和FT-IR结果显示CLA-CS的成功合成,CLA在CS上的取代度约为9.03%。TEM结果显示Dox NPs呈球形,无黏连,DLS结果显示Dox NPs粒径约323.33 nm,电位为35.7 mV,在吸附miR34a和HA后,粒径分别降低至240.1 nm和180 nm,电位降至35.3 mV和16.5 mV。体外释放结果显示CCmDH NPs具有一定的pH敏感性,在酸性介质pH5.0 PBS中比生理介质pH7.4 PBS中更易释放Dox,且在96h内具有一定的缓释特性。3)琼脂糖凝胶电泳结果显示,miR34a NPs、CCmD NPs和CCmDH NPs均能有效荷载miR34a,与naked miR34a相比,CCmDH NPs在48 h内能有效保护miR34a免受血清FBS的降解,在24 h内保护miR34a免受RNase酶的降解。4)细胞摄取实验结果显示,CCmDHNPs可在8 h内被MCF-7/A细胞摄取,红色的Dox主要集中在细胞核内,而绿色的miR34a主要在细胞质中散在分布,流式细胞仪结果显示,与naked miR34a,miR34a NPs和CCmD NPs相比,CCmDH NPs可显著促进miR34a的摄取;同时与游离Dox,Dox NPs,CCmDNPs相比,CCmDH NPs可显著促进Dox的细胞摄取。qRT-PCR结果显示,与MCF-7细胞相比,MCF-7/A细胞中miR34a水平显著降低,空白NPs、naked miR34a、Dox均不能引起细胞内miR34a表达水平升高,而miR34a NPs、CCmD NPs和CCmDH NPs均能引起MCF-7/A细胞内miR34a表达水平升高,说明所构建测CCmDH NPs能有效将miR34a转导入MCF-7/A细胞内。且Western blotting实验结果显示,与MCF-7相比,MCF-7/A细胞高表达CD44受体,这就解释了为什么相比于非靶向CCmD NPs,靶向CCmDH NPs更能明显升高MCF-7/A细胞中miR34a的表达。5)所合成的CLA-CS在0.01～1 mg/mL范围内对正常细胞HUVEC的增殖没有明显的影响,说明其可以作为药物载体使用。MTT结果显示,随着给药时间延长（24 h至96 h）和给药剂量的升高（10 μM和20μM）,CCmDH NPs可剂量依赖性和时间依赖性的抑制MCF-7/A的增殖。Hoechst实验结果显示,对照组,空白纳米粒组和miR34a组细胞核显示饱满、圆形或椭圆形,无收缩或碎裂,染色质着色均匀,蓝色荧光均匀分散,而对于CCmDHNPs组,可见典型的凋亡特征,如染色质凝结,细胞核断裂或缩小,蓝色荧光增多,出现凋亡小体。Western blotting实验结果显示CCmDH NPs组Cleaved PARP表达显著升高,而Bcl-2蛋白的表达显著降低。6)空白纳米粒组和miR34a组和7 μM Dox几乎对细胞迁移和侵袭没有影响,但CCmD NPs和CCmDH NPs组细胞的迁移明显被抑制,且CCmDH NPs的抑制作用更强。同时与细胞迁移相关的蛋白E-cadherin的表达在CCmDH NPs组明显升高,而N-cadherin、MMP2、CD44和Snail蛋白的表达显著降低。7)小动物活体成像结果显示,在相同的Dox剂量下,与游离Dox相比,裸鼠单次尾静脉给予CCmDHNPs,Dox的荧光主要集中在肿瘤部位,且可持续至96 h,而Dox在24 h后就渐渐被代谢,小鼠肿瘤部位几乎检测不到Dox的荧光强度,在96 h后解剖小鼠,分离心肝脾肺肾和肿瘤,发现在CCmDHNPs组小鼠的肿瘤部位仍能检测到Dox明显的红色荧光,说明CCmDHNPs不仅具有肿瘤靶向性还具有一定的缓释特性。8)裸鼠移植瘤实验结果显示,与生理盐水组相比,CCmDHNPs组抑瘤率约为 73.7%,而 Dox,miR34a 或 CCmD NPs 组抑瘤率分别为 55.3%,42.5%,33.9%,提示由于HA 靶向作用的存在,CCmDHNPs抑瘤率最高。Western blotting结果显示,CCmDHNPs组与凋亡相关的蛋白Bcl-2显著降低,Bax显著升高,与侵袭转移相关的蛋白E-cadherin明显升高,N-cadherin和Snail表达显著降低。免疫组化和免疫荧光结果显示空白组Snail蛋白高表达,而CCmDH NPs组Snail蛋白表达显著降低,以上实验说明Snail是CCmDHNPs发挥抗肿瘤作用的一个关键靶点。分子机制研究发现,CCmDH NPs可显著抑制Notch/NF-κB和Ras/Raf/Mek/Erk 信号通路中 K-Ras、NF-κB 和 Notch 的表达。小结:CS/miR34a NPs可显著抑制乳腺癌细胞的增殖、侵袭和转移,CCmDH NPs呈球形,粒径约180 nm,电位约16 mV,可抵抗血清和RNase的降解,被MCF-7/A细胞摄取,引起细胞内miR34a水平升高,可通过调控Bcl-2/Bax和PARP的表达促进细胞凋亡,通过调控E/N-cadherin、CD44、Snail、MMP2的表达抑制细胞侵袭转移,在体内外均具有一定的缓释效应和靶向效应,在裸鼠体内可显著抑制MCF-7/A移植瘤的生长,抑制Notch/NF-κB和Ras/Raf/Mek/Erk信号通路。研究结论:1)miR34a可显著提高耐药乳腺癌细胞对Dox的敏感性,Dox和miR34a合用可显著抑制体外耐药乳腺癌细胞的增殖、侵袭和转移,诱导细胞凋亡,并抑制体内耐药乳腺癌细胞的增殖。二者发挥协同抗耐药乳腺癌的作用机制是通过直接调控Snail或通过Notch/NF-κB和Ras/Raf/Mek/Erk信号通路来调控Snail而实现。2)所制备的基于CLA-CS和CD44靶向共载Dox和miR34a纳米给药系统（CCmDH NPs）可同时荷载Dox和miR34a,保护miR34a免受血清和RNase的降解,具有较好的稳定性,可显著促进Dox和miR34a进入MCF-7/A细胞,通过抑制 Bcl-2、N-cadherin、CD44、Snail、MMP2 等的表达和促进 Bax、PARP、E-cadherin等的表达,从而在体内外抑制耐药MCF-7/A细胞的生长、侵袭和转移以及促进凋亡,此外,CCmDH NPs可显著抑制Dox耐药的乳腺癌的进展可能与调控Notch/NF-κB和Ras/Raf/Mek/Erk信号通路有关。