目的:NK细胞是固有免疫系统中一类大颗粒淋巴细胞,其主要表达CD56分子和/或CD16分子,不表达CD3分子,在抗肿瘤及抗病毒反应中均起到了重要的作用,是免疫系统的第一道防线。根据其表面的不同标志物可将NK细胞划分为不同的亚群,不同的亚群发挥着不同的功能,包括细胞因子分泌、杀伤靶细胞以及免疫调节作用。单细胞测序作为一项新兴的技术,主要被应用于细胞类型鉴定、细胞异质性、信号通路差异响应及分子调控网络等方面的研究。HIV的感染会导致NK细胞亚群分布及功能的改变,但利用单细胞测序技术研究健康对照及HIV感染者总NK细胞亚群变化还尚未见报道;针对人类CD56⁺NK细胞,出现了以CD11b、CD27分子划分的新的分群方式,而在对HIV感染的研究中,有关新的分群方式来定义CD56⁺NK细胞亚群及功能的研究仍未见报道;HIV感染导致NK细胞中CD56^-CD16⁺亚群数量的增加,该亚群的杀伤功能及细胞因子分泌功能减弱,但CD56^-CD16⁺亚群是否发挥着免疫调节功能未知。本研究探究了HIV感染者总NK细胞（CD56⁺NK细胞及CD56^-NK细胞）通过单细胞测序技术来揭示NK细胞亚群特征及分布的改变（论文一）;探讨了HIV感染者CD56⁺NK细胞应用CD11bCD27定义后各个亚群的功能及其调节作用的研究（论文二）;并对HIV感染者CD56^-NK细胞的变化及调节作用进行了较为深入的研究（论文三）,为HIV感染的机制研究和相关免疫治疗提供新的思路及方向。研究方法:1.研究对象本研究所使用的对象均来源于中国医科大学艾滋病研究所红丝带门诊的HIV感染者及男同队列的HIV阴性健康对照者。健康对照者为HIV抗体、乙肝、丙肝均为阴性的健康男性。研究中纳入了59名HIV未治疗感染者、ART治疗者28名及39名健康对照者为研究对象。所有入选者均为男性且年龄相匹配。入选对象签署了知情同意书,并获得了中国医科大学附属第一医院伦理委员会的批准。2.CD4⁺T细胞绝对计数EDTA抗凝负压真空采血管采集研究对象外周血,将TriTESA-CD4-FITC/CD8-PE/CD3-PerCP染料与全血于流式管中混合,进行室温避光染色,再加入溶血素溶解红细胞,使用BD FACSCalibur流式细胞仪进行上机检测,应用MultiSET软件进行计算CD4⁺T细胞绝对数。3.外周血单个核细胞的提取应用PBS稀释混匀负压真空采血管中采集的全血,使用移液管缓慢匀速加入至Ficoll液面上,密度梯度离心后使用加样枪吸取细胞层后使用PBS洗涤细胞两次。4.多色流式细胞术检测细胞表面采用UltraComp eBeads^TM Compensation Beads进行补偿校准。CD3-PerCp-Cy5.5/FITC、CD56-PE-Cy7、CD16-BV510、CD11b-APC、CD27-PE、NKG2A-PE、NKG2D-PE、NKG2C-PE、CD11c-PE、CD57-PE、Tigit-PE、CCR7-Percp、CD8-APC-Cy7,CD279（PD-1）-BV421及各染料的isotype作为阴性对照。4℃避光染色30min后使用含有2%的FBS洗涤两次后应用使用LSR II流式细胞仪上样检测。5.NK表面代谢物质的检测CD3-PerCp-Cy5.5/FITC、CD56-PE-Cy7、CD27-BV510、CD11b-APC、Glut-1-PE、CD98-FITC、CD36-APC-Cy7进行4℃避光染色30min后使用含有2%的FBS洗涤两次后应用使用LSR II流式细胞仪上样检测。6.分选NK细胞及NK亚群提取PBMC后使用NK负选试剂盒（EasySep?Human NK Cell Enrichment Kit）富集PBMC中的NK细胞。NK亚群的分选:提前一天使用1-2ml R10放入流式管中,使R10充分湿润管壁后放入4℃冰箱中过夜。次日提取PBMC后,使用含有EDTA的PBS洗细胞两次,300g,10min,进行表面染色,CD3-PerCP-Cy5.5,CD56-PE-Cy7、CD16-APC、CD8-APC-Cy7、CD11b-APC、CD27-PE 4℃,30min,避光,染色结束后使用含有2%FBS的PBS洗细胞,350g,5min,重复两次。弃掉上清后使用含有EDTA的PBS重悬细胞至2-3ml,使用Aria II分选仪进行分选。7.多色流式细胞术检测胞内因子计数细胞后使用R10重悬后加入至U底96孔板中,保证每孔中含有0.2-0.5million个PBMC,在PBMC周围孔中补200ul PBS以保证目的孔湿度,在PBMC中加入10 ng/mL人重组IL-12、50 ng/m L rIL-15、100 ng/mL rIL-18刺激PBMC 24小时同时加入CD107a-APC-Cy7及isotype,在收细胞前的6小时,在每孔中加入1ul的Golgistop,收细胞时,使用加样枪吹打孔中细胞后收入标记好的流式管中,并用200ul PBS冲洗孔两次,保证PBMC全收入至流式管中。在流式管中加入2ml的PBS,350g,5min,洗细胞,重复两次。在最后一次洗细胞后,使用PBS将细胞重悬至200ul,使用振荡器混匀后进行表面染:CD3-PerCP-Cy5.5,CD56-PE-Cy7,CD16-BV510荧光抗体染色,避光染色30min,4℃,用2%FBS洗涤细胞,350g,5min,重复此步骤两次,洗去未结合染料。破膜及胞内染色:每管中加入250ul破膜剂,避光,室温进行破膜20min,20min后离心,500g,5min,使用1ml破膜洗液洗涤细胞以去除破膜剂,使用IL-10-APC、TGF-β-PE及IFN-γ-FITC染胞内,4℃,避光,30min染色,结束后使用1×破膜洗液1ml/管洗涤细胞,500g,5min,弃上清后重悬至200ul,使用LSR II流式细胞仪上样检测。8.NK细胞亚群胞内Granzyme B及Perforin的检测实验中使用K562细胞系刺激NK细胞,K562细胞系使用PBS洗涤后,按照2 ul/5million比例加入Cell-Trace-Violet用于标记K562细胞系,37℃,5%CO₂,20min,避光染色。染色结束后使用含有FBS的R10终止染色5_-10min,R10洗涤细胞,300g,10min,重复两次。计数细胞,调整细胞比例,效靶比（PBMC:K562=5:1）,使细胞数在0.2-0.5 million/200ul,种入96孔板中培养6h。培养结束后使用加样枪将培养板中的细胞移入标记好的流式管中,200ul PBS重复洗涤孔板。2ml 2%FBS洗涤细胞,300g,10min,重复两次,弃掉上清废液,加入7AAD,Vortex混匀细胞,15min内上机检测。9.CD4⁺T细胞增殖的抑制试验使用流式分选分选出CD4⁺T细胞及CD11b-CD27-NK亚群及CD11b-CD27+NK亚群,使用Cell-Trace-Violet用于标记CD4+T细胞,20min,37℃染色后按照NK:CD4⁺T细胞比例为1:1种入96孔板中,按照1million cells/25ul anti-CD3/28 beads刺激细胞,同时加入10 ng/m L r IL-12、r IL-15 50 ng/mL,100ng/mL r IL-18培养72h后将细胞收至流式管中,使用PBS洗涤细胞两次,弃上清后混匀细胞,按照1million cells/1ul live/dead染料。室温染色10min后,PBS洗涤两次,重悬细胞至200ul,上样检测。10.CD8⁺T细胞分泌IFN-γ的抑制试验将分选后的NK细胞及标记后的CD8+T细胞使用R10重悬,按照1:1的比例放入96孔板中,向其中加入10 ng/m L rIL-12、rIL-15 50 ng/m L,100 ng/m L r IL-18,5μg/mL phytohemagglutinin,及200 U/m L的rIL-2,培养24小时,在培养结束的前6小时,加入1ul的Golgistop,收细胞时,使用加样枪吹打细胞后移入标记好的流式管中,再使用200ul的PBS洗涤培养孔,重复两次。向流式管中加入PBS2ml,300g,10 min,洗涤两次。弃掉废液后使用振荡器混匀细胞,加入250ul的破膜剂,室温,20min,避光破膜。破膜结束后500g,5min离心,再使用1×的破膜洗液洗涤两次,500g,5min。弃掉上清后,使用振荡器混匀细胞,加入IFN-γ-FITC,4℃避光染色30min。染色结束后使用1×破膜洗液去除多余的染料,重悬细胞至200ul,使用流式细胞仪检测CD8+T细胞分泌IFN-γ情况。11.NK细胞IL-10、TGF-β及PD-L1的封闭试验提取新鲜PBMC后,进行表面染色,CD3-PerCP-Cy5.5,CD56-PE-Cy7,CD16-APC,CD8-APC-Cy7,4℃避光染色30min,使用含有2%FBS的PBS 2-3ml洗涤细胞,300g,10min,重复两次,去除未结合的染料。染色结束后使用含有EDTA的PBS 2-3ml重悬细胞,使用Aira II流式分选仪分选NK细胞。分选细胞后,使用PBS洗涤细胞两次,使用R10重悬细胞,将其放入96孔板中,在其中加入25ng/ml anti-IL-10 mAb,5ug/ml anti-TGF-βmAb,anti-PD-L1 mAb 0.25ug/10⁶ cells及匹配的同型对照,孵育1-2h,孵育完成后加入IL-12/IL-15/IL-18及PHA、IL-2,刺激24h,在刺激完成的前6h加入Golgistop。12.统计学分析用GraphPad Prism 6软件及SPSS 20.0对实验结果进行统计学分析。两组间比较用Mann–Whitney U检验,配对比较用Wilcoxon signed-rank检验。p<0.05（双侧）被认为是具有统计学差异。结果:一、单细胞测序揭示HIV感染者总NK细胞亚群特征1.健康对照者NK细胞基因水平的亚群分布特征排除了T细胞及B细胞等非NK细胞干扰后,发现NK细胞在单细胞基因层面可被划分为更细致的10个亚群。C0亚群高表达的基因分别是COL6A2,CD3G,CD3D,PTGDS,CD3E,IL32,KLRC2,PRDX2,GZMH;C1亚群高表达的前10个基因为FCER1G,CMC1,KLRC1,CD7,KLRB1,AKR1C3,CD160,SPON2,CLIC3,C1orf162;C2亚群为CD3E,LAG3,TNFRSF18,CLIC3,IL32 CD52,GZMH,KLRC2,GTF3C1,TRG-AS1;C3亚群为S100B,SELL,CD2,CLECL1,CD3D,PRSS57,CD3G,CLEC2D,CD3E,CD52;C4亚群为IGFBP7,ALOX5AP,KIR2DL1,GZMH,MIAT,KLRC2,FGFBP2,LAG3,PFKP,ADGRG1;C5亚群为ZFP36,FOS,CD69,PPP1R15A,NFKB1A,DUSP1,CCL3,JUN,JUNB,ZNF331;C6亚群为JUN,NFKB1A,CD69,IER3,TNF,PPP1R15A,CCL4,NFKBIZ,BTG2,ZC3H12A;C7亚群FOS,DUSP1,ZFP36,GZMK,CMC1,XCL1,JUN,PPP1R15A,CD69,LTB;C8亚群C1orf56,HNRNPH1,MDM4,TMEM120B,CDC42SE1,C16orf54,B4GALT1,APOBEC3C,PHKG1,B3GNT7;C9亚群STMN1,PCNA,MCM7,TYMS,DUT,TUBA1B,PCLAF,MCM5,MCM3,GINS2,每个亚群基因富集到的功能各不相同。2.健康对照者及HIV感染者NK细胞相关性分析健康对照者与HIV感染者NK细胞数量及亚群分布均有显著差异,两例样本合并后的典型相关性分析可将NK细胞共划分为0-11,共12个亚群（CC0-CC11）。在对两个样本在每个亚群占比分析中,CC0、CC3及CC5这三个亚群中HIV感染者的细胞要明显多于健康对照者,而CC1-2、CC4、CC8-9群中,健康对照者的细胞显著高于HIV感染者。3.HIV感染导致NK细胞功能改变在HIV感染样本细胞数量占比较多的亚群进行分析中发现,CC0中HIV感染者下调的基因多集中于I型干扰素信号通路、对病毒的反应及调节免疫反应中。而在CC3中,下调基因集中于I型干扰素信号通路、T细胞共刺激、调节免疫反应等等,CC5亚群中下调基因也富集于I型干扰素信号通路、对病毒反应及调节免疫反应。而在那些HIV感染者细胞比例减少的亚群中发现CC1富集到的基因还参与IFN-γ介导的信号通路,CC2、CC4的基因还涉及到了病毒的转录,CC8-CC9下调基因参与了病毒防御反应。二、HIV感染者CD11b CD27定义的CD56⁺NK细胞各个亚群功能及其调节作用的研究1.HIV感染者CD11bCD27定义的CD56⁺NK细胞各个亚群的变化未治疗HIV感染者CD11bCD27定义的CD56⁺NK细胞各个亚群与健康对照者相比出现明显的差异,未治疗HIV感染者的CD11b⁺CD27^-亚群百分比显著降低,而CD11b^-CD27^-亚群百分比显著升高。2.HIV感染者CD11bCD27定义的CD56⁺NK细胞活化性受体增高HIV感染者活化性受体NKp44及NKp46在CD11bCD27定义的NK细胞各个亚群中的表达均高于健康对照者,且四个亚群中CD11b^-CD27^-亚群的活化性受体表达最低。说明HIV感染后NK细胞表现出高活化的状态。3.CD11b^-CD27^-亚群呈现幼稚的表型特征在对各个亚群成熟度的研究当中,无论是HIV感染者或是健康对照者CD11b^-CD27^-亚群低表达成熟marker——CD11c,同时HIV感染者的CD11c在四个亚群中的表达均高于健康对照者;HIV感染者CD11b^-CD27^-亚群低表达衰老marker——CD57,CD11b^-CD27^-亚群幼稚marker——CCR7高于CD11b⁺CD27^-亚群。4.CD11bCD27定义的NK细胞亚群checkpoint点的表达水平在HIV感染者中显著升高HIV感染者各个亚群Tigit的表达均显著高于健康对照者,四个亚群中Tigit表达最高的是CD11b⁺CD27^-亚群;而PD-1的配体PD-L1在HIV感染者中CD11b^-CD27^-亚群的表达最低。5.CD11bCD27定义的NK细胞亚群代谢特征HIV感染者CD11b^-CD27^-亚群低表达葡萄糖转运体Glut-1,两组人群的比较无显著性差异;CD11b^-CD27^-亚群低表达脂质受体CD36,而氨基酸受体CD98的表达仅高于CD11b⁺CD27^-亚群。6.CD11b^-CD27^-亚群分泌IFN-γ及CD107a的脱颗粒功能不良细胞因子刺激NK细胞后检测各个亚群分泌IFN-γ及CD107a脱颗粒的情况,四个亚群中CD11b⁺CD27⁺亚群高表达IFN-γ及CD107a,其次是CD11b^-CD27⁺亚群,CD11b⁺CD27^-亚群低于前两个亚群,CD11b^-CD27^-亚群最低。7.CD11b^-CD27^-NK亚群颗粒霉及穿孔素储存能力良好,释放能力受损未经刺激时HIV感染者四个亚群中CD11b^-CD27^-NK亚群的Granzyme B及Perforin最高,而经过刺激后CD11b^-CD27^-NK亚群储存的Perforin则显著下降。8.CD11b^-CD27^-NK亚群分泌负向调节因子分选各个亚群经过细胞因子刺激后收集培养上清进行ELISA检测IL-10及TGF-β发现CD11b^-CD27^-亚群能分泌大量的IL-10及TGF-β。9.CD11b^-CD27^-亚群抑制CD4⁺T细胞增殖分选HIV感染者CD11b^-CD27^-亚群及CD11b⁺CD27^-亚群,分别将其与CD4⁺T细胞进行共培养,经过TCR刺激后发现CD11b^-CD27^-亚群具有能够抑制CD4⁺T细胞的增殖的趋势。三、HIV感染者CD56^-NK细胞的变化及调节作用的研究1.HIV感染者CD56^-CD16⁺NK细胞百分比显著升高HIV感染者CD56^-CD16⁺NK细胞的百分比较健康对照者相比显著升高,经过ART治疗后百分比虽有所下降,但未降至正常水平;HIV感染者CD56^dimCD16⁺NK细胞百分比明显低于健康对照者,ART组的CD56^dimCD16⁺NK细胞百分比有所回升但仍未达到健康对照者的水平。2.HIV感染者CD56^-CD16⁺NK细胞分泌高水平的IL-10及TGF-β对比HIV感染者CD56^-CD16⁺NK细胞及CD56^dimCD16⁺NK细胞表达的IL-10及TGF-β发现CD56^-CD16⁺NK细胞高表达IL-10及TGF-β,且未治疗HIV感染者与ART患者CD56^-CD16⁺NK细胞表达的IL-10及TGF-β无差异。3.HIV感染者CD56^-CD16⁺NK细胞亚群抑制CD8⁺T细胞功能分别将CD56^-CD16⁺NK细胞及CD56^dimCD16⁺NK细胞与自体的CD8⁺T细胞进行共培养后发现CD56^-CD16⁺NK细胞能够抑制CD8⁺T细胞的IFN-γ分泌,且抑制率与CD56^-CD16⁺NK细胞的比例呈正相关。4.阻断CD56^-CD16⁺NK细胞分泌的IL-10及TGF-β可部分恢复CD8⁺T细胞的功能培养体系中加入IL-10及TGF-β相应的抗体后,CD8⁺T细胞分泌的IFN-γ得到了部分的恢复,抑制率明显下降。5.CD56^-CD16⁺NK细胞通过直接接触的方式抑制CD8⁺T细胞功能分离培养实验证实CD56^-CD16⁺NK细胞除了间接接触的方式抑制自体的CD8⁺T细胞功能外还能够通过直接接触的方式抑制CD8⁺T细胞分泌IFN-γ。6.HIV感染者CD8⁺T细胞高表达PD-1,CD56^-CD16⁺NK细胞高表达其配体PD-L1HIV感染者CD8⁺T细胞较健康对照者的CD8⁺T细胞相比,高表达抑制性分子PD-1,同时HIV感染者的CD56^-CD16⁺NK细胞上的PD-L1较CD56^dimCD16⁺NK细胞相比表达增高,说明CD56^-CD16⁺NK细胞可能通过高表达的PD-1/PD-L1来发挥抑制作用。7.封闭PD-L1后可部分恢复CD8⁺T细胞的功能对CD56^-CD16⁺NK细胞高表达的PD-L1进行了抗体封闭试验后,该亚群对自体CD8⁺T细胞的抑制作用明显减弱。结论:1.总NK细胞根据单细胞测序可分为10个亚群,HIV感染者NK细胞I型干扰素信号通路基因下调,影响NK细胞抗病毒作用。2.CD56⁺CD11b^-CD27^-NK亚群在HIV感染中显著升高,该亚群展现低活化,幼稚的表型,葡萄糖转运能力低,脂质及氨基酸受体高于CD56⁺CD11b⁺CD27^-NK亚群,同时该亚群细胞功能不良,能够分泌负向细胞因子,抑制CD4⁺T细胞增殖。3.CD56^-CD16⁺NK亚群增高,抑制自体CD8⁺T细胞功能,CD56^-CD16⁺NK细胞的分泌大量IL-10及TGF-β,高表达抑制性受体的配体PD-L1,并通过直接接触（PD-1/PD-L1）及间接接触（IL-10及TGF-β的分泌）的方式抑制CD8⁺T细胞分泌IFN-γ,阻断PD-L1的表达或封闭IL-10及TGF-β能够恢复CD8⁺T细胞功能。