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目的:糖尿病肾病(Diabetic nephropathy,DN)是糖尿病患者严重的微血管并发症,是导致终末期肾脏疾病的主要原因,致残率及死亡率高。DN的发病率在全球范围内持续上升,其发病机制较为复杂,目前尚未完全阐明,且临床防治难度较大。因此,积极寻找基于糖尿病肾病发病机制的新的干预靶点迫在眉睫,已成为糖尿病及肾脏病专家热切关注的课题。有研究显示自噬在多种动物模型中起到肾脏保护的作用,它可以通过调节溶酶体生物合成来清除晚期糖基化终末产物(Advanced glycation end-products,AGEs)。自噬系统对维持肾小管细胞及足细胞的功能非常重要,自噬有望成为DN新的防治靶点。Sirtuins这种NAD依赖性脱乙酰酶家族,其亚型(Sirt1和Sirt2)已被证明参与自噬-溶酶体途径,Sirt3可通过改善线粒体自噬对衰老心肌发挥保护作用,缓解氧化应激导致的细胞衰老,但Sirt3在糖尿病肾组织自噬中的作用研究尚少。晚近研究报道,在DN发病过程中,自噬受到多种途径的调控。Notch通路和自噬之间的相互作用在细胞中普遍存在,可能是通过调节Notch受体有关的细胞生物活动而发挥作用。因此,本课题进一步深入研究,探讨Sirt3及Notch通路对高糖环境下人肾小管上皮细胞及DN患者肾组织自噬的影响,以阐明其内在机制,为研究DN新的干预靶点提供实验型依据。虽然关于DN的机制研究很多,但延缓和治疗DN的临床干预措施却很少。AGEs诱导DN患者肾小管上皮细胞自噬失活,吡哆胺(Pyridamines,PM)是维生素B6的天然形式之一,它可以直接清除羰基类化合物,因而是AGEs的强抑制剂。由此推测,PM能够通过调控自噬功能,起到DN的肾保护作用。为证明我们研究的预期结论,在本课题中,观察了Sirt3及自噬相关指标在高糖刺激人肾小管上皮细胞和DN肾组织中的表达,进一步应用质粒转染技术过表达Sirt3及通过Si RNA沉默Sirt3,并加用Notch通路特异性激活剂Jagged-1,探讨Sirt3及Notch信号通路对自噬的影响。此外,研究吡哆胺调控高糖刺激人肾小管上皮细胞自噬的机制,及Sirt3在此过程中的作用,为寻找DN有效的治疗药物提供科学依据。方法:1.Sirt3在高糖环境下人肾小管上皮细胞自噬中的作用及Notch通路参与的机制研究1)进行HK-2细胞培养,将各组细胞同步化后,分成正常糖对照组(5.5mmol/L glucose,NG)、高渗组(5.5 mmol/L glucose+24.5 mmol/L mannitol,M)、高糖组(30 mmol/L glucose,HG)分别培养6h、12h、24h、48h、72 h,指定时间刺激结束后收集细胞的总蛋白,Western blot检测相关蛋白。2)为观察Sirt3对高糖环境下HK-2细胞自噬及Notch通路的影响,首先过表达Sirt3,实验分为4组:正常糖对照组(5.5 mmol/L glucose,NG)、高糖组(30 mmol/L glucose,HG)、高糖+空质粒组(30 mmol/L glucose+p CMV-vector,HG+p CMV-vector)、高糖+p CMV-Sirt3组(30 mmol/L glucose+p CMV-Sirt3,HG+p CMV-Sirt3)。各组细胞经同步化,干预刺激48小时后,收集细胞的总蛋白和RNA,采用Western blot和RT-q PCR检测相关蛋白和m RNA。3)然后予Si RNA抑制Sirt3,实验分为4组:正常糖对照组(5.5 mmol/L glucose,NG)、正常糖Sirt3-si RNA组(NG+Sirt3-si RNA)、高糖组(30mmol/L glucose,HG)和高糖Sirt3-si RNA组(HG+Sirt3-si RNA)。所有组经同步化,干预刺激48h后,收集细胞的总蛋白和RNA,采用Western blot和RT-q PCR检测相关蛋白和m RNA。4)为进一步研究Sirt3对高糖刺激下肾小管上皮细胞自噬的作用是否与Notch通路相关,在过表达Sirt3的基础上加入Notch通路特异性激活剂Jagged-1,将实验分为5组:正常糖对照组(5.5 mmol/L glucose,NG)、高糖组(30 mmol/L glucose,HG)、高糖空质粒组(HG+p CMV-vector)、高糖Sirt3质粒组(HG+p CMV-Sirt3)、高糖Sirt3质粒Notch通路特异性激活剂组(HG+p CMV-Sirt3+Jagged-1)。所有组经同步化,干预刺激48h后,收集细胞的总蛋白和RNA,采用Western blot和RT-q PCR检测相关蛋白和m RNA。2.Sirt3在糖尿病肾病患者肾组织的表达及与自噬的关系研究选取经肾活检病理检查确诊为DN的患者20例,另外20例相对正常肾组织(选自我院肾错构瘤或肾脏肿瘤切除术病灶旁组织经病理检查为正常的组织)作为对照组,组织切片进行HE、PAS、Masson染色,免疫组化检测Sirt3、LC3-Ⅱ、Beclin-1和P62表达。选取20例无糖尿病病史且肾功能正常体检者作为生化指标的正常对照,检测肾功能、血糖、糖化血红蛋白、血浆白蛋白和24小时尿蛋白定量。3.吡哆胺对高糖环境下人肾小管上皮细胞保护机制的研究1)进行HK-2细胞培养,正常糖(NG)或高糖(HG)和/或PM(0.01m M、0.1 m M、1 m M、10 m M或100 m M)处理细胞48h后,应用CCK8法检测细胞活性,选择最佳药物浓度用于后续实验。2)为明确吡哆胺对高糖环境下HK-2细胞自噬及Notch通路的影响,实验分为4组:正常糖对照组(5.5 mmol/L glucose,NG)、吡哆胺对照组(5.5 mmol/L glucose+1 m M PM,NG+PM)、高糖组(30 mmol/L glucose,HG)和高糖吡哆胺组(30 mmol/L glucose+1 m M PM,HG+PM)。将各组细胞同步化,干预48h后,收集细胞的总蛋白和RNA,采用Western blot和RT-q PCR检测相关蛋白和m RNA;免疫荧光检测Sirt3与LC3-Ⅱ在HK-2细胞的定位和表达。3)为研究Sirt3在吡哆胺对高糖环境下HK-2细胞所产生作用的影响,予Si RNA沉默Sirt3,将实验分为4组:正常糖对照组(5.5 mmol/L glucose,NG)、高糖组(30 mmol/L glucose,HG)、高糖吡哆胺组(30 mmol/L glucose+1 m M PM,HG+PM)和高糖吡哆胺Sirt3-si RNA组(30 mmol/L glucose+1 m M PM+Sirt3-si RNA,HG+PM+Sirt3-si RNA)。将各组细胞同步化,干预48h后,收集细胞的总蛋白和RNA,采用Western blot和RT-q PCR检测相关蛋白和m RNA;免疫荧光检测Sirt3与LC3-Ⅱ在HK-2细胞的定位和表达。结果:1.Sirt3在高糖环境下肾小管上皮细胞自噬中的作用及Notch通路参与的机制研究1)当分别给予NG、M、HG 6h、12h、24h、48h、72h,Sirt3在HG干预12h时显著上升,当干预48h时降低。LC3-Ⅱ和Beclin-1蛋白在HG干预12h时均上升,P62蛋白表达下降。当干预48h时LC3-Ⅱ和Beclin-1蛋白表达下降,P62蛋白表达上升。Notch-1和Hes-1蛋白在HG干预48h时显著上升。2)与NG组相比,HG显著降低了LC3-Ⅱ和Beclin-1蛋白的表达,降低了Sirt3和LC3-Ⅱm RNA的表达;增加了HK-2细胞P62、Notch-1和Hes-1蛋白的表达,增加了Notch-1 m RNA的表达。与HG+p CMV-vector组相比,HG+p CMV-Sirt3组HK-2细胞LC3-Ⅱ和Beclin-1蛋白的表达升高,Sirt3 m RNA表达显著增高,LC3-Ⅱm RNA表达增高;P62、Notch-1和Hes-1蛋白表达降低,Notch-1 m RNA表达降低。3)与NG组相比,NG培养基中加入Sirt3-si RNA后,LC3-Ⅱ和Beclin-1蛋白表达降低,LC3-Ⅱm RNA表达降低,Sirt3 m RNA几乎不表达;P62、Notch-1和Hes-1蛋白表达增加,Notch-1 m RNA表达增加。与HG组相比,HG+Sirt3-si RNA组HK-2细胞LC3-Ⅱ和Beclin-1蛋白表达显著降低,LC3-Ⅱm RNA表达降低;P62、Notch-1和Hes-1蛋白表达增加,Notch-1 m RNA表达增加。4)当加入Notch通路激活剂Jagged-1后,HK-2细胞LC3-Ⅱ和Beclin-1蛋白表达降低,Sirt3 m RNA变化不显著,LC3-Ⅱm RNA表达降低;P62、Notch-1和Hes-1蛋白表达增高,Notch-1 m RNA表达增高。2.Sirt3在糖尿病肾病患者肾组织的表达及与自噬的关系研究1)与对照组相比,DN组患者FBG、Hb A1C、BUN、Scr和UPE水平明显升高;2)HE、PAS和Masson染色:对照组受试者肾组织结构未见明显异常,DN组肾小球肥大伴部分硬化,肾小球基底膜增厚,系膜基质增生,部分患者肾小球毛细血管基底膜弥漫增厚,可见Kimmelstiel-Wilson结节形成。部分肾小管萎缩,肾间质部分出球小动脉可见透明样变性和胶原纤维增生。3)Sirt3、LC3-Ⅱ、Beclin-1和P62在免疫组化实验中的表达:Sirt3、LC3-Ⅱ和Beclin-1能够在对照组肾组织广泛表达,Sirt3主要定位在肾小管上皮细胞和肾小球系膜细胞的细胞浆中,呈染色深度不等的棕黄色颗粒状。Sirt3在对照组受试者肾组织中阳性率为75%,DN组患者Sirt3表达量(45%)显著低于对照组。LC3-Ⅱ主要定位在肾小管上皮细胞和肾小球系膜细胞细胞浆,偶见于胞核。LC3-Ⅱ在对照组受试者肾组织中阳性率为65%,显著高于DN组(30%)。Beclin-1主要定位在肾小管上皮细胞和肾小球系膜细胞浆中,呈颗粒状棕黄色。Beclin-1在对照组受试者肾组织中阳性率为70%,高于DN组(60%)。P62主要定位在肾小管上皮细胞和肾小球系膜细胞核和细胞浆。染色呈棕黄色,P62在对照组受试者肾组织中阳性率为25%,DN组患者P62表达量(40%)显著高于对照组。3.吡哆胺对高糖环境下人肾小管上皮细胞保护机制的研究1)高糖对HK-2细胞活性具有损害作用,PM可缓解高糖所致的HK-2细胞损伤,1 m M作用最为明显,后续试验中选择1 m M作为干预剂量;2)与NG组相比,HG显著降低Beclin-1、LC3-II和Sirt3蛋白和m RNA的表达,增加HK-2细胞P62、Notch-1、Hes-1和RAGE蛋白和m RNA的表达。当HG组加入PM(1m M)干预48h后,HK-2细胞Beclin-1、LC3-II和Sirt3蛋白和m RNA的表达较HG组升高,P62、Notch-1、Hes-1和RAGE蛋白和m RNA的表达降低。免疫荧光显示与NG组相比,HG组HK-2细胞质中Sirt3和LC3-Ⅱ表达减少,PM干预后Sirt3和LC3-Ⅱ的荧光强度显著增加;3)给予Sirt3-si RNA干预后,HG+PM+Sirt3-si RNA组LC3-Ⅱ和Beclin-1蛋白和m RNA的表达降低,P62、RAGE、Notch-1和Hes-1蛋白和m RNA升高。免疫荧光强度值分析结果显示,给予Sirt3-si RNA干预后Sirt3不表达,LC3-Ⅱ阳性细胞数显著减少。结论:1.高糖可使人肾小管上皮细胞Sirt3表达下降,Notch-1/Hes-1通路激活,自噬功能发生障碍。2.Sirt3通过调控Notch-1/Hes-1通路,进而调节肾小管上皮细胞自噬功能。3.DN患者肾组织LC3-Ⅱ和Beclin-1表达下降,提示自噬功能减弱;Sirt3表达下降,Sirt3可能影响DN肾组织自噬。4.吡哆胺可抑制Sirt3介导的Notch-1/Hes-1通路,诱导肾小管上皮细胞自噬功能激活,发挥肾脏保护作用。