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柑橘黄龙病(Citrus Huanglongbing,HLB)是当前世界柑橘产业的头号杀手。该病能侵染几乎所有的柑橘栽培品种,目前尚无有效治愈手段。其病原暂定于α-变型菌纲(Proteobacteria)、韧皮杆菌属(Liberibacter),是一种韧皮部专性寄生的难培养革兰氏阴性细菌,根据16S rDNA序列不同可将其分为三个种:亚洲种(‘Candidatus Liberibacter asiaticus’,Las)、非洲种(‘Ca.Liberibacter africanus’,Laf)、美洲种(‘Ca.Liberibacter americanus’,Lam),其中Las分布最广,且危害最大。迄今,在柑橘栽培种中尚未发现黄龙病抗性基因,严重制约了抗性育种的进程。有研究表明,马蜂柑(Citrus hystrix)对黄龙病具有一定的耐病性,但其耐病机制尚不清楚。中国是世界柑橘的重要起源中心,有着丰富的野生柑橘资源,而这些野生资源对黄龙病的抗感性缺乏系统研究。因此,本研究以马蜂柑、宜昌橙(C.ichangensis)、道县野橘(C.daoxianensis)等野生柑橘资源为研究材料,以甜橙(C.sinensis)为敏感对照品种,接种毒源后进行生物学症状观察,并利用定量多聚酶链式反应(Quantitative Polymerase Chain Reaction,qPCR)定期检测Las在不同寄主中的含量变化;同时对其进行比较转录组分析,以期从转录水平上解析野生柑橘和甜橙对Las的应答机制差异,为抗/耐黄龙病常规和转基因育种提供新思路。所获得的主要研究结果如下:1.通过毒源嫁接和qPCR定期检测,结果表明,野生柑橘和甜橙均在接种约90 d能检测到Las。进一步比较宜昌橙、道县野橘和甜橙中病原菌含量的变化,发现从接种约120 d开始,Las在甜橙中的含量远高于宜昌橙和道县野橘,初步表明Las在甜橙中的增殖速度高于野生柑橘;症状观察发现,马蜂柑和宜昌橙几乎不显症,道县野橘部分叶片出现轻微黄化,而甜橙感染黄龙病后表现出明显的叶片变小、黄化的现象,表明马蜂柑和宜昌橙对黄龙病具有潜在的耐病性。2.对感染初期的耐病品种马蜂柑和感病品种甜橙进行了转录组测序,筛选出耐病相关的差异表达基因并进行了qPCR验证。结果表明,甜橙感染Las后共有604个基因差异表达,其中254个上调,350个下调,而马蜂柑感染Las后共252个基因差异表达,其中179个上调,73个下调,染病马蜂柑与染病甜橙相比共有4651个基因差异表达,其中2137个上调,2514个下调。Las诱导的代谢途径涉及糖代谢、光合作用、细胞壁代谢、次生物质代谢、PR-蛋白(Pathogenesis Related Protein)、氧化还原反应等。值得注意的是,与健康对照相比,染病甜橙中编码淀粉合成酶(glgA)的两个基因上调表达4倍以上,与淀粉分解有关的β-淀粉酶(BAM)基因下调表达,而它们在染病马蜂柑中表达无显著差异。染病马蜂柑中大部分与细胞壁和次生产物代谢途径相关的基因上调表达,而甜橙中该途径相关基因大部分下调表达。另外,多个与植物抗病相关的PR-蛋白相关基因被Las诱导差异表达,部分抗病蛋白相关基因的表达水平较敏感品种更高。RT-qPCR验证结果表明,在挑选的20个差异表达基因中,18个基因的验证结果与RNA-seq测序结果的变化趋势基本保持一致,表明了RNA-seq具有较高的可靠性和准确性。3.对宜昌橙、道县野橘和甜橙进行了感病后期的转录组测序,结果显示,宜昌橙、道县野橘和甜橙接种Las约240 d分别有592、987和2844个基因差异表达,与其接种Las后的显症程度呈现出一致性。Las侵染后期,与致病相关的淀粉合成、PP2蛋白相关基因在甜橙和道县野橘中均上调表达,尤其是甜橙,但在宜昌橙中没有明显变化,推测可能是宜昌橙不显症的主要原因。同时,次生产物代谢途径在3个品种中被激活,纤维素合成相关基因在宜昌橙和道县野橘中上调表达,但在甜橙中下调表达;甜橙中大量PR-蛋白相关基因表达被抑制,而宜昌橙和道县野橘相对较少;部分抗病蛋白基因在野生柑橘品种中表达水平较高。4.不同野生柑橘品种对Las侵染的应答反应存在一定的相似性,尤其是马蜂柑和宜昌橙。4个柑橘品种感染黄龙病后,与植物防御相关的代谢途径中大量差异表达基因均被诱导上调表达。然而,3个野生柑橘品种中均有部分抗病蛋白相关基因的表达水平较甜橙更高,在一定程度上增强了耐病性。此外,道县野橘中淀粉代谢、PP2蛋白相关基因的表达虽上调但不及甜橙显著,推测这可能是道县野橘染病后出现轻微黄化的主要原因,而马蜂柑和宜昌橙中该类基因均未被诱导差异表达,这与它们表现出的较高耐病性相符合。总而言之,生物学和转录组学研究在一定程度上揭示了野生柑橘(马蜂柑和宜昌橙)的耐病机制。