鸡球虫病是由艾美耳属球虫引起的一种重要的寄生虫病。球虫感染能造成鸡群的增重率和产蛋率下降,甚至直接引起死亡。全球每年因球虫病导致的经济损失超过三十亿美元。鸡球虫病传统的控制方法主要依赖于抗球虫药物的使用和接种活疫苗。但是,由于耐药虫株的不断产生和药物残留的日益严重,使抗球虫药使用受到了限制。球虫活疫苗又存在着生产成本高、难保存等缺点,促使人们寻求治疗球虫病的新途径。新型疫苗比如DNA疫苗和亚单位疫苗,存在着安全性高、生产成本低等优点,越来越受到人们的关注。微线蛋白Microneme Proteins(MICs)介导虫体对宿主细胞的识别和接触,偏菱形样蛋白Rhomboid-like Proteins(ROMs)裂解微线蛋白,使虫体释放完全进入宿主细胞,所以,ROMs在虫体入侵过程中起到关键作用。然而由于顶复门原虫存在多种ROMs,不同种原虫ROMs功能也不相同。E.maxima是否存在ROMs,存在几种ROMs,是否这些蛋白酶分子都参与了粘附素分子的裂解,目前还不能确定。在本实验的前期研究中,通过表达文库免疫筛选到了E.maxiEa偏菱形样蛋白(EmRP),该蛋白具有良好的免疫保护性。除了 EmRP之外,E.maxima是否还存在其他种类的ROMs?在这些ROMs中,哪一些蛋白参与裂解MICs,裂解哪些MICs?这些问题都不清楚。为探究E.maxima偏菱形样蛋白在球虫入侵过程中的作用,本实验从以下几方面进行了研究:1 E.maxima偏菱形样蛋白基因的克隆表达及子孢子定位为了获得巨型艾美耳球虫所有的偏菱形样蛋白基因,根据EMBL-EBI中4个假定偏菱形样蛋白基因设计了 4对简并引物,以巨型艾美耳球虫的cDNA为模板,对4个基因进行PCR扩增,然后对它们进行了序列分析,原核表达,制备了多克隆抗体,最后对4个基因用免疫荧光的方法进行了子孢子定位分析。最终获得了 4个巨型艾美耳球虫的全序列,根据它们与弓形虫偏菱形样蛋白的相似性,分别命名为EmROM1,EmROM2,EmROM3和EmROM5,序列分析表明它们都含有偏菱形样蛋白超家族成员的保守区域,且都为非跨膜蛋白,子孢子定位实验证明4个基因均在子孢子阶段表达且均分布在子孢子的表面。2E.maxima偏菱形样蛋白相互作用的微线蛋白的筛选为了确定与偏菱形样蛋白相互作用的微线蛋白,运用DUALhunter starter kit酵母双杂交系统,以 pDHB1-EmROM1、pDHB1-EmROM2、pDHB1-EmROM3 和pDHB1-EmROM5 为诱饵载体,以 pPR3-N-EmMIC1、pPR3-N-EmMIC2、pPR3-N-EmMIC3、pPR3-N-EmMIC4、pPR3-N-ErmMIC5、pPR3-N-EmMIC7 和 pPR3-N-EmAMA1为捕获载体,进行了 4轮筛选实验。结果证明:EmROM1和EmROM3与EmMIC1,EmMIC2 有相互作用,EmROM2,EmROM5 与 EmMIC2 有相互作用。3 E.maxima偏菱形样蛋白对微线蛋白的裂解作用研究为验证巨型艾美耳球虫EmROMs基因和EmMIC1,EmMIC2之间是否存在裂解作用,构建了 真核表达质粒 pVAX1-Flag-EmROMs 和 pVAX1-Flag-EmMIC1,pVAX1-Flag-EmMIC2,以 pVAX1-Flag-galectin 为无关蛋白对照,随后转染 Hela 细胞,通过免疫荧光和western blot的方法检测两个蛋白的表达情况及裂解作用,结果表明:EmROM1和EmROM3对EmMIC1有裂解作用。4 E.maxima偏菱形样蛋白EmROM3免疫原性研究为了研究EmROM3的免疫原性,构建了真核表达质粒pVAX1-EmROM3,腿部肌肉注射免疫2周龄的雏鸡,3周龄加强免疫,分别对一免后,二免后一周的鸡进行采血,分离血清,分离脾脏淋巴细胞,用ELISA的方法检测血清特异性IgG水平;用Q-PCR方法检测细胞因子水平,用流式细胞术来检测T淋巴细胞中CD4+,CD8+的含量。实验结果表明,此真核表达质粒可以刺激机体细胞因子的增高,T淋巴细胞亚型的增殖,可以作为巨型艾美耳球虫基因疫苗的候选基因。