论文部分内容阅读
目的:关节软骨损伤严重影响着人们的生活质量,同时骨关节软骨疾病开始趋于年轻化。目前临床上治疗此类疾病的方法主要包括自体或同种异体软骨移植,但给供区造成新的损伤,同时供体来源有限,不能满足临床需求。本研究在相关文献报道基础上,利用天然材料丝素和胶原蛋白,冷冻干燥法来制备复合支架,TGF-β1联合IGF-1诱导BMSCs作为种子细胞,构建组织工程化培养模型,在微环境下诱导BMSCs向软骨细胞分化。方法:1.采用密度梯度离心法分离大鼠BMSCs,体外培养扩增并观察其特征。2.软骨方向诱导鉴定:取第三代BMSCs,加入软骨诱导液,2周后分别行甲苯胺蓝和番红素O染色。3.丝素蛋白/胶原蛋白组织工程支架的制备:以桑蚕丝和牛腱为原料制备丝素蛋白和胶原蛋白,将二者溶液按不同比例进行共混,冷冻,真空干燥,制备复合支架(编号1,2,3组)。检测每组支架材料的孔隙率、吸水率、力学性能、孔径。取第三代骨髓间充质干细胞(BMSCs)接种支架,培养14天,利用噻唑蓝(MTT)、苏木素-伊红(HE)染色、扫描电镜(SEM)观察每组支架内部结构及细胞在内部的生长增殖。4.组织工程化培养模型的建立:构建组织工程化培养模型。实验共分三组:A组(联合诱导)、B组(无诱导)和C组(空白对照组)。5.阿利新蓝法测定培养模型体的酸性糖胺多糖的含量。6.组织工程化培养模型体外培养2周,利用免疫组化检测复合体中Ⅱ型胶原的表达。结果:1.采用密度梯度离心法成功分离大鼠BMSCs。3次传代后,BMSCs基本无杂质细胞,纯度较高。2.采用甲苯胺蓝染色、番红素O鉴定诱导后软骨细胞表型。结果表明BMSCs具有多向分化潜能。3.1,2,3组孔隙率分别为94.6%±1.6%、80.6%±1.1%、60.6%±1.0%,组间比较差异均有统计学意义(P<0.05);吸水膨胀率分别为1623.7%±186.6%、991.0%±151.6%、559.6%±161.4%,组间比较差异有统计学意义(P<0.05);支架均具有较好的粘弹性,弹性模量分别为(23.1±6.3)kPa、(25.1±5.1)kPa、(29.8±6.9)kPa,组间比较差异无统计学意义(P>0.05);孔径分别为(189±12)μm、(110±15)μm、(60±16)μm,组间比较差异有统计学意义(P<0.05);MTT检测表明1组活细胞增殖高于2、3组(P<0.05);HE染色见支架内部1组细胞数量明显多于2、3组;SEM下观察1组支架相通性好,细胞在支架内部生长良好;2、3两组支架孔隙间相通性差,细胞在内部生长较差。4.A组培养液上清中GAG含量明显高于B组和C组(P<0.05);A组GAG单日分泌量呈逐渐上升,B组和C组GAG单日分泌量始终维持低水平。表明A组细胞呈现软骨特性。5.A组表达Ⅱ型胶原,B组和C组则无Ⅱ型胶原的表达。结论:1.密度梯度离心法成功分离大鼠BMSCs,分离的BMSCs有定向分化潜能。2.利用丝素、胶原两种天然材料的生物相容性较好的优势,用不同的混合比例制备支架材料,获得孔隙连通性好,孔径适中的复合支架。初步探索了丝素/胶原复合支架中两种材料的质量比例问题,同时对复合支架的相关性能进行了初步研究,为后续的进一步研究指明了方向。3.TGF-β1联合IGF-1诱导BMSCs接种到支架上,体外成功构建组织工程化形态软骨模型。A组培养模型培养两周后,成功的证实了其成软骨能力。