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研究背景:肝纤维化影响着全球数百万人的生命健康,目前尚无有效的治疗药物。肝细胞损伤后的死亡是肝纤维化的触发因素。在纤维化的起始阶段,存在着多种形式的肝细胞死亡,包括坏死、凋亡和程序性坏死。程序性坏死（Necroptosis）是一种受到精密调控的“新型”细胞死亡方式,混合激酶样蛋白（MLKL）是程序性坏死通路的终末效应器。虽然程序性坏死已被报道在多种类型的疾病中扮演重要角色,但MLKL在肝纤维化中的作用尚未报道。因此,我们研究了MLKL在肝纤维化发生中的作用及其机制,并探究了利用基因疗法靶向MLKL治疗肝纤维化的效果,为临床治疗肝纤维化提供了新靶点和方法。研究方法:首先分析临床肝纤维化/肝硬化病人的肝活检样本以及肝纤维化小鼠的组织样品,检测MLKL在病理状态下的表达,评估MLKL是否参与肝纤维化的发生发展。随后,基于CRISPR-Cas9技术构建Mlkl基因敲除小鼠(Mlkl-/-),采用四氯化碳（CCl4）和胆管结扎手术（BDL）诱导WT和Mlkl-/-小鼠肝损伤和纤维化,进一步探究MLKL在肝脏炎症以及肝纤维化中的作用。接着,分离肝纤维化发生过程中的关键细胞:免疫细胞、肝细胞和肝星状细胞（HSCs）进行体外实验,详细解析敲除Mlkl缓解肝损伤及肝纤维化发生的分子机制。最后,利用腺相关病毒（AAV8）设计靶向Mlkl的基因疗法,在CCl4诱导的肝纤维化小鼠模型中探究靶向肝细胞的Mlkl治疗纤维化的效果。研究结果:临床样本的检测结果表明,基因和蛋白水平上,肝纤维化患者的肝脏样本中MLKL的表达与纤维化标志物均呈强相关性。在小鼠肝纤维化模型上,我们观察到一致的实验现象。这些结果表明,MLKL可能参与了肝纤维化的发生和发展过程。随之,我们利用CRISPR-Cas9技术构建Mlkl基因敲除(Mlkl-/-)小鼠,并在CCl4诱导的肝损伤和BDL导致的胆汁淤积模型上评估敲除Mlkl对肝损伤的影响。我们发现,敲除Mlkl可以显著缓解CCl4和BDL导致的急性、慢性肝损伤和肝脏炎症;肝脏组织中浸润的免疫细胞、中性粒细胞、外周迁移的巨噬细胞、促炎巨噬细胞的数目显著降低。持续的肝脏炎症反应会发展成纤维化,我们继续在WT和Mlkl-/-小鼠上评价CCl4和BDL诱导的肝纤维化的程度。我们发现,造模后,与WT小鼠相比,Mlkl-/-小鼠肝纤维程度显著减轻,具体来说Mlkl-/-小鼠肝脏组织纤维化相关的基因和蛋白水平均显著低于WT鼠。肝损伤触发免疫细胞骨髓迁移到损伤部位,并极化成促炎或抑炎巨噬细胞。我们最初观察到敲除Mlkl,小鼠肝脏巨噬细胞的数目明显降低。因此,首先从WT和Mlkl-/-小鼠骨髓中分离Bone marrow-derived macrophage（BMDM）,体外诱导分化为M1型促炎巨噬细胞和M2型抑炎巨噬细胞。但WT-BMDM和Mlkl-/--BMDM在分化上以及分泌细胞因子上并没有差异,我们认为MLKL并不影响BMDM的分化和分泌细胞因子的功能。肝细胞损伤后的死亡是肝纤维化发生的起始因素。继而,我们从WT和Mlkl-/-小鼠肝脏中分离肝细胞,体外给予损伤因素（CCl4和毒性胆汁酸）的刺激。检测细胞上清AST（指示肝细胞损伤）的释放以及进行台盼蓝染色（指示肝细胞死活）,结果表明,Mlkl-/--Hepatocytes相比WT-Hepatocytes损伤及死亡程度明显减轻。此外,损伤后,Mlkl-/--Hepatocytes相比WT-Hepatocytes,趋化因子（CCL2,CX3CL1）及炎症因子（IL-1β,IL-18）相关基因表达降低,同时程序性坏死通路相关蛋白（RIP1/p-RIP1,RIP3/p-RIP3等）表达明显被抑制。肝星状细胞的激活是导致纤维化的直接环节。为探究MLKL在肝星状细胞激活中的作用,我们从WT和Mlkl-/-小鼠肝脏中分离肝星状细胞,体外培养使其发生自激活,Mlkl-/--HSCs相比WT-HSCs激活程度明显降低,表现为α-SMA的表达降低,同时伴随TGFβ/Smad通路的抑制。以上研究结果表明,敲除Mlkl可以显著地缓解肝脏损伤导致的肝纤维化的发生。但MLKL在不同组织器官中的作用大相径庭,为设计开发直接靶向肝细胞内Mlkl治疗肝纤维化的方法,为此,我们利用腺相关病毒AAV8设计了特异性靶向肝细胞内Mlkl的基因疗法（AAV8-TBG-sh Mlkl）。我们发现,AAV8-TBG-sh Mlkl可以特异性的表达于肝细胞内,通过预防和治疗给药AAV8-TBG-sh Mlkl均可以显著缓解CCl4诱导的小鼠肝纤维化。研究结论:综上所述,我们发现,敲除Mlkl可以显著缓解化学及胆管结扎诱导的肝损伤、肝脏炎症和肝纤维化的发生。其作用机制为:1.敲除Mlkl可以显著缓解肝细胞损伤和死亡（包括程序性坏死）和继而诱发的免疫反应。2.敲除Mlkl可以显著抑制肝星状细胞的激活,其机制是抑制TGFβ/Smad信号通路的激活。MLKL介导的信号通路在肝损伤、肝脏炎症和肝纤维化中发挥着重要作用,MLKL有望成为治疗肝纤维化的有效靶点。创新点:MLKL在肝纤维化中的作用尚未报道,我们发现MLKL敲除可以减轻四氯化碳和胆管结扎诱导的小鼠肝脏炎症和肝纤维化。深入的机制研究发现,MLKL敲除可缓解肝细胞损伤以及肝星状细胞的激活。基于机制部分的研究结果,我们利用基因疗法靶向MLKL治疗肝纤维化,达到了很好的治疗效果。目前尚无抗纤维化的药物上市,我们的研究结果为临床治疗肝纤维化提供了新靶点和方法。