本实验以体外培养并纯化的骨髓间充质干细胞为种子细胞,与自制的脱细胞角膜基质支架材料附和,并经形态学观察与动物移植检验其生物特性和组织相容性;对角膜上皮细胞的体外培养体系进行了探讨,并采用Transwell共培养体系诱导骨髓间充质干细胞向角膜上皮细胞方向分化;旨在通过对种子细胞和支架材料的系统研究,以探索有效的组织工程角膜制备方法,为临床组织工程角膜制备和应用提供依据。具体操作和结果如下:1.密度梯度法分离幼兔骨髓间充质细胞,以DMEM/F12为基础培养基,添加10% FBS,100IU/mL青霉素和100μg/mL链霉素,PH 7.2~7.4,37℃饱和湿度进行培养,原代培养第2天,可见大量成纤维样细胞贴壁密集生长,镜下观察成旋涡状,第5天可以传代,选择第2或3代贴壁细胞作为种子细胞。实验显示培养的骨髓间充质干细胞表现出良好的生长和分化性能,可作为较理想的组织工程种子细胞。2.采用胰酶和DNA酶联合消化法对猪角膜进行脱细胞处理,经液氮反复冻融,促使角膜内的各种细胞破裂,彻底脱除角膜细胞成分,冻干保存得到支架材料;生物学检验显示,冻干支架材料呈白色疏松片状形态,厚约1-2 mm;DMEM复水3 h后呈半透明且与正常角膜韧性、厚度和强度相近;光镜下观察显示角膜上皮与基质中的细胞脱除完全,无残留,上皮基底膜完整,胶原纤维无断裂,结构疏松,整体成网状结构;扫描电镜观察可见脱细胞基质胶原板层结构完整,材料呈三维立体网格状结构;细胞培养附和实验观察到种子细胞可以在基质上良好生长;将支架材料移植到角膜缘干细胞完全缺失动物病理模型眼表以观察其生物相容性及对眼表恢复效果,结果未见明显的炎症反应与排斥,角膜生长良好。3.无菌取家兔全层角膜,用含各100 U/mL青霉素和链霉素的PBS冲洗后,经1.2U/mL DispaseII酶消化,用含血清的培养基中和终止消化。剥离角膜上皮组织,弃去基质,离散细胞,离心后弃上清,加入适量含10% FBS,20 ng/mL EGF, 5 ng/mL胰岛素的培养液,制成浓细胞悬液,接种于塑料培养瓶;37℃5% CO2饱和湿度,每48 h换液,待细胞增殖铺满瓶底80%～90%时进行传代,得到角膜上皮细胞。采用Transwell共培养体系对角膜上皮细胞和BMSC进行非接触式共培养,形态学观察显示培养15d左右,细胞由成纤维样形态变成铺路石样,显示骨髓间充质干细胞在体外被诱导分化为角膜上皮细胞。