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蓝藻是海洋食物链中主要初级生产者,其生存状态对整个生物圈的良性循环十分重要。由于蓝藻起源于远古前寒武纪,至今仍在高盐,强碱等多种逆境中广泛分布,它们如何识别环境信号,在漫长的进化过程中形成了怎样的逆境适应分子机制,是长期以来蓝藻生物学领域重点研究但尚未解决的基本问题之一。搞清楚这一问题,对从根本上理解蓝藻细胞对不断变化的环境条件的适应机理,发现能够有效地促进或控制这类重要生物类群生长与繁殖的新途径,具有重要的理论和实践意义。集胞藻6803是数十年来用于研究光合作用调控机理的模式生物。由于其结构简单,起源于淡水但对盐胁迫有中度忍耐性,又可进行遗传转化,因此也被认为是研究包括盐胁迫在内的蓝藻逆境适应分子机理的理想材料。1996年该藻种基因组序列的确定,为从基因组和蛋白组同时切入,全面系统地研究蓝藻逆境适应分子机理提供了新的机遇和大规模操作的平台,推进了近年来对盐胁迫适应过程中蛋白组学和基因组学研究,并且取得了一系列重要进展。但是,与盐胁迫适应(几天)相比,人们对蓝藻细胞如何识别不同的环境信号并进行转导的分子机制还了解甚少。
本文以集胞藻6803野生型(Wt)和组氨酸激酶基因缺失突变体(△Hik33)为材料,采用亚细胞蛋白质组学手段,通过比较分析对这一问题进行探讨。首先从正常培养条件和盐胁迫(24小时)的野生型和突变体细胞中将可溶性蛋白和膜蛋白组分离,然后利用蔗糖密度离心和水溶性两相分离相结合的方法,获得分离纯化的质膜和类囊体膜,并分别构建了可溶性蛋白和膜组分的一维(SDS-PAGE)和二维蛋白质凝胶电泳(2D-PAGE)图谱。对一维图谱的分析发现,hik33基因的缺失引起了细胞蛋白组的明显变化,其中质膜和可溶性蛋白组分的变化较类囊体膜蛋白组分更为明显。对可溶性蛋白组分二维凝胶电泳图谱的差异蛋白分析结果表明,在正常培养条件下,与野生型相比,突变体可溶性蛋白组中有5个蛋白的丰度明显降低,17个蛋白的丰度明显增加；而在盐胁迫条件下,有17个蛋白的丰度明显降低,5个蛋白的丰度明显提高.对质膜蛋白组分二维凝胶电泳图谱的差异蛋白分析结果表明,在正常培养条件下,与野生型相比,突变体中有21个蛋白的丰度明显降低,15个蛋白的丰度明显增加；而在盐胁迫条件下,有20个蛋白的丰度明显降低,21个蛋白的丰度明显增加。对发现的这些差异蛋白点进行胶内消化,并采用MALDI-TOF和MALDI-TOF/TOF进行鉴定。通过对鉴定蛋白进行系统的功能分析,获得以下主要结果:1)在正常培养条件下,hik33的缺失突变体中丰度降低的可溶性蛋白有4个,而质膜蛋白有16个,其中S1r1452和S1r0559是首次报道的负责硫酸盐和天然氨基酸转运的质膜新蛋白；2)在盐胁迫条件下,突变体中丰度降低的可溶性蛋白有16个,主要为代谢酶类,其中参与氮素同化的酶类丰度降低最为明显,包括参与GS-GOGAT循环的两个蛋白(GlnA、GltD)和参与尿素分解及硝酸盐还原的UreC和NirA蛋白；3)在盐胁迫条件下,hik33的缺失突变体质膜组分中有15个蛋白的丰度明显下降,其中1/3为底物不同的转运蛋白；4)在正常培养条件下,hik33的缺失突变体丰度提高的蛋白共27个,而在盐胁迫条件下有19个,其中包括OCP、Vippl、UrtD、MtrC、Pdhb及Rre13等重要功能或调节蛋白。这些研究结果对阐明蓝藻细胞识别盐胁迫信号的分子机制提供了重要线索和材料。