论文部分内容阅读
第一部分重组慢病毒LV5-PML(?NLS)的构建及其对NB4细胞增殖与凋亡的影响目的:通过重组慢病毒介导的PML(ΔNLS)过表达,研究其对白血病NB4细胞增殖与凋亡的影响,并对其作用机制进行探讨。方法:以真核质粒p CMV-HA-PML(?NLS)为PCR反应模板,体外扩增PML(?NLS)基因,克隆入慢病毒载体LV5-EF1a-GFP/puro,与包装辅助质粒p Helper 1.0、p Helper 2.0在脂质体2000的作用下共转染293T细胞,包装病毒。利用重组慢病毒LV5-PML(ΔNLS)感染NB4细胞,RT-PCR法验证PML(?NLS)m RNA的转录程度,Western blot检测PML(?NLS)、Akt、p-Akt(ser473)、S6和p-S6(ser235/236)蛋白表达的变化。CCK-8实验观察各组细胞增殖活力;100 nmol/L雷帕霉素处理各组细胞,24h后流式细胞术分析细胞凋亡和周期的变化。结果:成功构建携带PML(?NLS)的慢病毒,病毒感染NB4细胞,感染效率达82.74%,LV5-PML(?NLS)携带的PML(?NLS)能够在NB4细胞中稳定表达;感染LV5-PML(?NLS)的NB4细胞中p-Akt(ser473)和p-S6(ser235/236)蛋白表达上升(P<0.05),而Akt和S6蛋白表达无明显变化;CCK-8结果显示,与未感染组和感染LV5-NC组相比,感染LV5-PML(ΔNLS)组NB4细胞增殖活力明显上升(P<0.05);流式细胞术结果显示,感染重组慢病毒PML(ΔNLS)组G1期细胞比例下降,进入S期细胞比例增多,且凋亡率明显低于感染LV5-NC组和未感染组(P<0.05)。结论:成功构建了重组慢病毒PML(?NLS),PML(?NLS)过表达可通过活化Akt信号通路促进NB4细胞体外增殖,降低其凋亡率,并影响S6蛋白磷酸化。第二部分氯化锂对NB4细胞增殖与凋亡的作用目的:利用氯化锂处理NB4细胞,探讨其对NB4细胞增殖与凋亡的影响。方法:以0-40 mmol/L浓度的氯化锂作用于NB4细胞,培养24 h,CCK-8实验观察细胞增殖情况,Western blot检测各种细胞Akt1蛋白表达水平。以20 mmol/L浓度的氯化锂作用于NB4细胞,培养24 h,FCM法分析细胞凋亡与周期变化,Western blot检测各组细胞b-catenin,p-GSK-3,GSK-3 and c-Myc蛋白表达水平。结果:0-40 mmol/L氯化锂抑制NB4细胞增殖,使Akt1蛋白表达下降。20 mmol/L氯化锂作用于NB4细胞后,细胞凋亡率上升,细胞周期阻滞在G2/M期,c-Myc蛋白表达下降,p-GSK-3,b-catenin蛋白表达上调,GSK-3β蛋白表达无明显变化。结论:氯化锂可通过抑制GSK-3b促进NB4凋亡,诱导细胞周期阻滞在G2/M期;同时影响Akt1,b-catenin,c-Myc蛋白表达水平。