急性StanfordA型主动脉夹层是一个严重的心血管急症。此外,在以往出现过相关症状却又未经正规治疗的患者中,具有很高的死亡率和发病率。直到现在,主动脉夹层仍然是一个危及生命的重大疾病,而夹层的特征包括主动脉广泛的退行性病变、遗传和结构特征改变、复杂又潜在致命,但是对主动脉基层病理机制仍然不太清楚。因此,早期诊断和及时的预处理是绝对必要的。随着对主动脉夹层的认知不断增加,研究夹层的生物学标志物成为了研究热点之一。组织蛋白酶S是一种独特的半胱氨酸组织蛋白酶家族成员,限制组织,定位在淋巴和脾脏中的抗原呈递细胞以及其他免疫细胞如巨噬细胞的表达。生化层面上来说,组织蛋白酶S也不同于许多家庭成员,它能在中性pH值保持活性的能力独具一格。因此,这些特性突出组织蛋白酶S作为疾病治疗的理想靶点,与其高度限制的表达,治疗作用的抑制剂应尽量减少潜在的副作用。此外,其在中性pH值环境下,组织蛋白酶S具有突出高于其他家庭成员的稳定性,并且增加的参与细胞外蛋白水解活性的潜力。虽然有研究显示组织蛋白酶S参与腹主动脉瘤(AAA)的进程,但是组织蛋白酶S与A型夹层的关系与其在夹层中扮演的角色仍未可知,其分子机制或者相关通路仍然知之甚少。在本课题研究中,我们首先探讨了组织蛋白酶S在夹层中的角色定位与前景,深化了组织蛋白酶S参与β-氨基丙腈单药诱导C57BL/6小鼠形成胸主动脉夹层模型的相关研究,进一步从分子机制研究了组织蛋白酶S可能的机制并影响大血管重构这一进程。为夹层和动脉瘤的预防和综合治疗提供一种新的思路,并进一步研究其生物学功能可能的分子机制。第一部分组织蛋白酶S在夹层中的角色定位与前景研究[目的]探讨组织蛋白酶S在大动脉血管壁重构中的角色以及评估组织蛋白酶S可否作为一种新的对急性夹层患者辅助诊断以及预后判断的生物标记物。[方法]本部分总共纳入162例StanfordA型夹层患者以及32例器官捐献者作为研究对象。对两者临床资料进行初步评估,同时对两者的组织标本进行Hematoxylin eosin(H.E),维多利亚蓝和马松染色。再行免疫组织化学和Western blotting进行评估两者组织的组织蛋白酶S的整体表达差异以及具体的表达定位。此外,检查患者血清学组织蛋白酶S水平、胱抑素C水平及血清D-二聚体水平,ROC曲线分析这些生物标志物,初步评估相关诊断价值以及指标的特异度和敏感度。Pearson相关分析用来评估术中、术后数据与组织蛋白酶S之间的相关性。[结果]组织学检查显示急性A型夹层中弹性蛋白和胶原蛋白降解,免疫组化显示血管平滑肌细胞染色呈强阳性。组织蛋白酶S在急性A型夹层患者组织中的表达,对比对照组的大动脉组织,Western blot结果显示两者整体表达具有统计学意义(p<0.05),而急性A型夹层患者的血清组织蛋白酶S和D-二聚体水平明显高于对照组(p<0.05)。此外,血清组织蛋白酶S的水平升高的趋势与组织中是一致的。ROC曲线分析结果证实,组织蛋白酶S是一种与D-二聚体具有类似灵敏度和特异性的血清标志物。Pearson相关分析提示升高的血清组织蛋白酶S水平与机械通气(MV)时间、术后住院时间(LOS)显著相关。[结论]组织蛋白酶S是一个在主动脉壁血管重构中不可忽视的关键因素。此外,组织蛋白酶S也可能是预测围手术期并发症和指导急性A型夹层患者的干预策略的一个有价值的工具。第二部分组织蛋白酶S参与fβ-氨基丙腈单药诱导C57BL/6小鼠形成胸主动脉夹层模型的相关研究[目的]胸主动脉夹层的基本病理机制仍不清楚,而且以往没有合适的动物模型,能够形成有效的干预治疗策略。我们要建立一个经济实用简便的动物模型,旨在探讨在组织蛋白酶S在主动脉壁血管重构中的作用和评价夹层相关蛋白的表达。[方法]选取一定数量C57BL/6小鼠作为实验对象,分为夹层组及对照组,对照组小鼠10只,予以正常喂食;夹层组小鼠10只,使用β-氨基丙腈(BAPN,0.4g/100g食料)喂食4周。对两组小鼠体重和体重变化进行监测。免疫组织化学和免疫印迹法对小鼠大动脉组织进行评估,明确组织蛋白酶S表达水平。此外,对组织蛋白酶S在夹层的中表达以及差异仍需要我们进一步观察,本部分将对夹层组与对照组之间进行组织蛋白酶S差异研究,同时检测与主动脉重构相关的蛋白质标。[结果]BAPN能成功诱导C57BL/6小鼠形成胸主动脉夹层。此外,胸主动脉夹层对小鼠体重具有明显的影响,夹层组小鼠生长趋势较正常组缓慢。组织病理学检查显示组织蛋白酶S在血管平滑肌细胞中高表达,而通过免疫印迹法结果显示小鼠组织中的组织蛋白酶S整体升高。夹层相关蛋白的表达中,MMP2在夹层组中表达明显上调,而MMP9、MMP3呈表达下调趋势;COL1A1和α-SMA在夹层组中表达均显著降低;而CTGF在两组间无明显统计学差异。这些结果表明,BAPN诱导产生的胸主动脉夹层涉及典型的ECM降解,可能通过MMP2,造成血管平滑肌细胞损失从而降低α-SMA,此部分结果与以前在人类中的研究结果具有一致性。[结论]我们已经建立了一个可靠的和经济方便的C57BL/6小鼠胸主动脉夹层模型,可以为以后病理过程研究和探索分子治疗目标提供了坚实基础,并为进一步的分子理论机制提供了一定依据。第三部分组织蛋白酶抑制剂通过I>I3K/Akt通路介导的p53、p21抑制血管平滑肌细胞重构[目的]验证组织蛋白酶S抑制剂在血管紧张素Ⅱ(Ang Ⅱ)刺激下在主动脉夹层形成期间调节血管平滑肌细胞(VSMCs)的表型变化,同时探讨PI3K/AKT信号通路介导的p53以及p21对这一过程的贡献。[方法]体外培养小鼠主动脉平滑肌细胞,传代后使用氯化钴六水合物模拟缺氧下的氧化应激反应。用最佳浓度梯度和最佳时间梯度的AngⅡ在体外干预小鼠主动脉血管平滑肌细胞(MOVAS),使用广谱组织蛋白酶抑制剂干预,验证抑制剂是否具有组织蛋白酶S选择性。体外细胞实验过程中组织蛋白酶抑制剂在PI3K/AKT信号通路的蛋白质表达的变化情况。用Western blotting检测血管平滑肌细胞表型标志物的变化。[结果]广谱组织蛋白酶抑制剂干预具有高度的组织蛋白酶S选择性。血管紧张素Ⅱ可以诱导血管平滑肌细胞表型转化。被组织蛋白酶抑制剂干预后,组织蛋白酶S表达受阻,p-Akt,p85、p53和p21的表达均下调。免疫印迹检测显示Ang Ⅱ刺激细胞使α-SMA表达降低,而骨桥蛋白的表达是上升的,使用组织蛋白酶抑制剂后,α-SMA、OPN展示了相反的结果,这些均由我们在体外实验验证。[结论]我们的结果已经表明,组织蛋白酶S抑制剂影响小鼠主动脉平滑肌细胞的PI3K/Akt通路,同时对血管平滑肌细胞的表型转换有相关作用。我们的数据支持组织蛋白酶抑制剂通过PI3K/Akt信号转导通路参与血管平滑肌细胞的相关调节。这些结果可能会提供另一种机制研究方向,即Ang Ⅱ诱导的血管平滑肌细胞表型转化促进夹层的形成过程中,我们拥有了组织蛋白酶S抑制剂这一个可能有吸引力的治疗干预靶点,旨在防治夹层的形成以及并发症策略。