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年龄相关性黄斑变性(Age-related Macular Degeneration，AMD)是一进行性、迟发性、退行性视网膜疾病，严重影响中心视力。AMD的病理改变主要是视网膜色素上皮细胞（(Retinal Pigment Epithelium，RPE）凋亡，但目前有关其具体分子机制和信号通路仍有待进一步研究。乙酰胆碱酯酶(Acetylcholinesterase，AChE)是一种B型的羧酸酯酶,它在神经胆碱能突触部位和神经肌肉接头处迅速水解和灭活乙酰胆碱，终止胆碱能神经信号的传递。以往研究表明，在多种类型细胞系诱导凋亡过程中，AChE的表达出现上调，从而提示AChE与细胞凋亡有关。 本项研究主要探讨AChE在RPE细胞凋亡中的作用，实验主要包括体外细胞和动物模型实验两部分。 第一部分：AChE在H2O2诱导RPE细胞凋亡中的作用 目的：观察正常体外培养和氧化应激状态下RPE细胞系中AChE的表达水平，并检测siRNA敲低AChE对H2O2诱导RPE细胞凋亡的保护作用。 方法：常规培养人RPE细胞系ARPE-19（ATCC），利用H2O2诱导RPE细胞氧化应激状态后，采用免疫荧光和Western blot检测RPE细胞不同状态下AChE的表达水平。同时用siRNA方法敲低细胞内源性AChE的表达，并通过TUNEL染色观察敲低AChE对H2O2诱导ARPE-19凋亡的保护作用。 结果：正常体外培养人RPE细胞系中存在低水平的AChE表达，但H2O2刺激后，ARPE-19细胞中AChE的表达水平显著升高（p＜0.01）。同时凋亡蛋白PARP的表达水平在H2O2刺激后也显著升高。转染AChE-siRNA能敲低ARPE-19细胞中AChE的表达，并有效保护H2O2诱导的细胞凋亡数量。 结论：AChE参与了H2O2诱导的ARPE-19细胞凋亡过程，敲低AChE能有效保护氧化应激诱导的细胞凋亡。 第二部分：乙酰胆碱酯酶抑制剂在乙酰胆碱酯酶敲除小鼠--129-AChEtm1loc/J中的相关研究 目的：分别观察正常人、大鼠、小鼠视网膜组织中AChE的表达；并检测不同浓度AChE抑制剂它克林（Tacrine）和多奈哌齐（Donepezil）对不同年龄129-AChEtm1loc/J小鼠视网膜的保护作用，从而探讨AChE在视网膜组织结构完整性中的作用。 方法：取眼球捐赠者（南昌大学附属眼科医院）的正常视网膜，成年大鼠、成年小鼠的视网膜，用免疫荧光方法检测正常视网膜中AChE的表达。另外，分别将0.1mg/ml、0.2 mg/ml、0.4 mg/ml Tacrine和Donepezil腹腔注射到2月龄、4月龄的AChE+/-和野生型的S129小鼠体内，连续注射7天，PBS作为空白对照组。30天后处死小鼠，体外心脏灌注PBS后取视网膜样本，用于制成冰冻切片或提取蛋白，用HE染色、免疫荧光、Western blot方法检测视网膜结构，及RPE层AChE的表达变化。 结果：正常人、大鼠及小鼠视网膜组织中RPE层中均存在低水平AChE的表达。另外，AChE+/-型小鼠视网膜较野生型小鼠视网膜更薄。2月龄时视网膜结构尚完整，但随着年龄的增大，AChE+/-型小鼠视网膜发育较野生型的迟缓。经腹腔注射Tacrine后，AChE+/-小鼠视网膜中AChE的表达显著下降（p＜0.01），且注射0.4 mg/ml Tacrine后对AChE+/-小鼠视网膜结构的保护作用最显著。Donepezil对AChE+/-小鼠视网膜结构的保护作用与Tacrine组相似，无显著差异（p＞0.01）。 结论：正常人、大鼠及小鼠视网膜组织中RPE层中均存在低水平AChE表达。注射Tacrine和Donepezil在体内可以抑制AChE的表达，且有利于视网膜结构的稳定。